Technika barwienia immunofluorescencyjnego do wykrywania neurogenezy hipokampa u dorosłych

Weźmy mysi wycinek mózgu składający się z zakrętu zębatego hipokampa, miejsca neurogenezy złożonego z neuronalnych komórek progenitorowych na różnych etapach różnicowania.

Przenieś przekrój do roztworu blokującego przepuszczalność. Cząsteczki detergentu w roztworze przenikają do komórek, podczas gdy białka blokują niespecyficzne miejsca wiązania.

Dodaj pierwszorzędowy koktajl przeciwciał ukierunkowany na określone markery neurogenezy, białko związane z mikrotubulami i białko pośrednie filamentu.

Usunąć niezwiązane przeciwciała. Wprowadź różne przeciwciała drugorzędowe znakowane fluoroforem wiążące się z przeciwciałami pierwszorzędowymi.

Dodaj białka surowicy od tego samego gospodarza, co jedno z przeciwciał pierwszorzędowych, nasycając paratopy przeciwciał drugorzędowych.

Wprowadź monowalentne fragmenty Fab, które nasycają epitopy białek surowicy, zapobiegając niespecyficznemu wiązaniu.

Dodaj drugie przeciwciało pierwotne podniesione przez tego samego gospodarza, wiążące się z innym pośrednim białkiem filamentowym.

Wprowadzić przeciwciała drugorzędowe znakowane fluoroforem skierowane przeciwko drugiemu przeciwciału pierwszorzędowemu.

Za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej zidentyfikuj podtypy progenitorów neuronów wyrażające unikalne kombinacje markerów.

Zacznij od przeniesienia skrawków z roztworu niezamarzającego do TBS za pomocą cienkiej szczotki. Dokładnie spłucz sekcje, zaczynając od mycia przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza, a następnie pięciu 10-minutowych prań w temperaturze pokojowej. Wszystkie te inkubacje powinny być wykonywane z ciągłym, delikatnym mieszaniem.

Jeśli jednym z interesujących antygenów jest analog tymidyny, w tym momencie należy przeprowadzić etap denaturacji kwasu solnego, a następnie etap neutralizacji w buforze boranowym. Kontynuuj przenikanie i blokowanie niespecyficznych miejsc wiązania przeciwciał w TBS-plus. Pozostaw tę inkubację na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.

Następnie inkubować pierwsze przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone w TBS-plus przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnego dnia umyj sekcje trzy razy w TBS i raz w TBS-T. Pozwól każdej kąpieli trwać 10 minut. Następnie inkubować w pierwszym przeciwciałie drugorzędowym sprzężonym z fluorochromem przez trzy godziny w temperaturze pokojowej. Od teraz chroń sekcje przed działaniem światła.

Po kolejnej serii przemywania przenieś skrawki do 10% roztworu surowicy gatunku gospodarza, z którego wytworzono dwa pierwszorzędowe przeciwciała. Inkubować skrawki w tym roztworze przez trzy godziny, aby nasycić otwarte paratopy na pierwszym przeciwciałie drugorzędowym. Później spłucz trzy razy w TBS i raz w TBS-T, aby usunąć serum.

Następnie należy przygotować roztwór TBS-plus z 50 mikrogramami na mililitr niesprzężonych monowalentnych fragmentów Fab skierowanych przeciwko gatunkom gospodarza przeciwciała pierwotnego. Obejmuje to epitopy, które w przeciwnym razie mogłyby zostać rozpoznane przez drugie przeciwciało drugorzędowe. Przenieś skrawki do tego roztworu i inkubuj przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Po inkubacji przepłukać skrawki co najmniej trzy razy w TBS i raz w TBS-T. Podczas przenoszenia przetrzyj wkładki siatkowe zawierające sekcje na ręczniku papierowym, aby usunąć resztki Fab. Teraz inkubuj skrawki drugiego przeciwciała pierwszorzędowego przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Po kolejnej serii płukania nałóż drugie przeciwciało wtórne na trzy godziny w temperaturze pokojowej. Na koniec umyj sekcje trzy razy w TBS i przystąp do montażu sekcji w żelatynie. Wysuszyć szkiełka i nakryć je na powietrzu za pomocą środka montażowego zapobiegającego blaknięciu.