Technika barwienia całego narządu do trójwymiarowego obrazowania nerki

Weź stałą nerkę myszy. Lipidy w tkance powodują rozpraszanie światła, a pigmenty powodują absorpcję światła, powodując, że komórki są nieprzezroczyste.

Potraktuj tkankę CUBIC-L w celu odlipidowania i odbarwienia. Aminoalkohol w CUBIC-L usuwa lipidy i pigmenty, minimalizując rozpraszanie światła i zwiększając przezroczystość.

Cząsteczki detergentu w CUBIC-L przenikają również do komórek.

Wprowadź pierwszorzędowy koktajl przeciwciał, który wiąże się z cytoplazmatyczną hydroksylazą tyrozynową w neuronach nerwów współczulnych i aktyną mięśni gładkich alfa w komórkach mięśni gładkich naczyń.

Dodaj przeciwciała drugorzędowe znakowane fluoroforem, które wiążą się z przeciwciałami pierwszorzędowymi.

Wykonaj postfiksację tkanki, aby zachować leczenie przeciwciałami.

Zanurz tkankę w CUBIC-R+, który zastępuje wodę i odpowiada współczynnikowi załamania światła białek, dodatkowo minimalizując rozpraszanie światła i zwiększając przezroczystość.

Pod mikroskopem fluorescencyjnym z arkuszami świetlnymi arkusze świetlne oświetlają tkankę, pobudzając fluorofory.

Uchwyć światło emitowane przez fluorofor i zrekonstruuj trójwymiarowy obraz, przedstawiający rozkład nerwów współczulnych wokół tętnic w nerkach.

Aby rozpocząć, wykonaj utrwalanie przez zanurzenie natychmiast po utrwaleniu perfuzyjnym i pobraniu próbki nerki, zanurzając nerkę w 4% paraformaldehydzie w temperaturze 4 stopni Celsjusza na 16 godzin. Wykonaj trzy płukania za pomocą PBS przez dwie godziny każde. Przeprowadź proces odbarwiania i delipidacji, zanurzając nieruchomą nerkę w siedmiu mililitrach 50% CUBIC-L w 14-mililitrowej probówce z okrągłym dnem, delikatnie potrząsając w temperaturze pokojowej.

Po sześciu godzinach zanurz nerkę w siedmiu mililitrach CUBIC-L w 14-milimetrowej rurce z okrągłym dnem, delikatnie potrząsając w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć dni. Odświeżaj CUBIC-L codziennie. Po zakończeniu odbarwiania i delipidacji użyj łyżki dozującej do obsługi próbki i przemyj nerkę trzykrotnie PBS w temperaturze pokojowej przez dwie godziny.

Immunowybarwić zdelipidowaną nerkę w przeciwciałach pierwotnych rozcieńczonych w barwiącym roztworze buforowym, delikatnie wstrząsając w wytrząsarce inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez siedem dni. Następnie umyj nerkę 0,5% Triton X-100 w PBS, znanym również jako PBST, w temperaturze pokojowej przez jeden dzień. W przypadku barwienia przeciwciałami wtórnymi należy traktować nerkę przeciwciałami drugorzędowymi w buforze barwiącym w ciemności, delikatnie potrząsając w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez siedem dni. Napraw plamę za pomocą prania PBST w temperaturze pokojowej na jeden dzień.

Po utrwaleniu zanurz nerkę w 1% formaldehydzie w PB na trzy godziny i myj ją PBS w temperaturze pokojowej przez sześć godzin. Wykonaj dopasowanie współczynnika załamania światła, zanurzając nerkę w siedmiu mililitrach 50% CUBIC-R+ w 14-mililitrowej probówce z okrągłym dnem z wytrząsaniem na jeden dzień, a następnie poddając się leczeniu siedmioma mililitrami CUBIC-R+ z wytrząsaniem w temperaturze pokojowej przez dwa dni.