Test immunofluorescencyjny do wykrywania agregatów alfa-synukleiny w sekcji biopsji skóry

Weźmy kriosekcję biopsji skóry od pacjenta z chorobą Parkinsona zamkniętego w pożywce.

Tkanka składa się z najbardziej zewnętrznego naskórka, leżącej poniżej skóry właściwej i podskórnej tkanki tłuszczowej unerwionej przez nerwy.

Umyj sekcję, aby usunąć medium do zatapiania. Przenieś go do roztworu blokującego przenikanie, przepuszczalnie komórki i blokując niespecyficzne miejsca wiązania.

Zanurz sekcję w pierwszorzędowym koktajlu przeciwciał, aby uzyskać jednolite znakowanie przeciwciał, zwane barwieniem swobodnie pływającym.

Przeciwciała wnikają do neuronów i wiążą się z agregatami alfa-synukleiny rozmieszczonymi wzdłuż aksonów – zagregowaną formą charakterystyczną dla chorób neurodegeneracyjnych – i hydrolazami karboksylowymi.

Wprowadź przeciwciała drugorzędowe sprzężone z fluoroforem, które wiążą się z przeciwciałami pierwszorzędowymi.

Potraktuj fluorescencyjnym barwnikiem wiążącym DNA, który barwi jądro.

Umieść chusteczkę na szkiełku podstawowym, nałóż podłoże montażowe i uszczelnij szkiełkiem nakrywkowym.

Pod mikroskopem konfokalnym fluorescencja obu przeciwciał ujawnia obecność agregatów alfa-synukleiny wzdłuż aksonów neuronów skórnych.

Na początek napełnij niektóre dołki świeżej 96-dołkowej płytki 100 mikrolitrami roztworu myjącego. Przenieść sekcje do analizy z płyty do przechowywania na płytę zawierającą roztwór myjący. Pozostaw skrawki w roztworze myjącym na 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przenieś każdą sekcję do pustej studzienki zawierającej ten sam roztwór myjący i powtórz pranie. Następnie dodaj roztwór myjący do sekcji i przenieś je do nowych studzienek zawierających 100 mikrolitrów roztworu blokującego. Inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 90 minut, a maksymalnie 4 godziny.

Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe, anty-PGP9.5 i anty-5G4 w roztworze roboczym. Przenieść skrawki do nowych studzienek zawierających 100 mikrolitrów roztworu roboczego przeciwciał pierwotnych i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej.

Następnego dnia umyj skrawki w studzienkach zawierających roztwór myjący, jak opisano wcześniej. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe - kozie anty-królicze w celu wykrycia anty-PGP9,5 i kozie anty-mysie w celu wykrycia 5G4 w roztworze roboczym.

Umyte skrawki przenieść do nowych studzienek zawierających 100 mikrolitrów roztworu roboczego przeciwciał wtórnych. Przykryj płytkę folią aluminiową, aby uniknąć bielenia fluoroforu sprzężonego z przeciwciałami drugorzędowymi i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 90 minut.

Następnie umyj sekcje dwa razy w roztworze myjącym, jak opisano wcześniej. Przenieś umyte odcinki do nowych studzienek zawierających 100 mikrolitrów DAPI przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Umyj sekcje dwa razy w roztworze myjącym, jak opisano wcześniej. Następnie zamontuj sekcje na prowadnicy we właściwej pozycji, unikając nieprawidłowego składania.

Dodaj kilka kropel podłoża montażowego do szkiełka i przykryj sekcję szkiełkiem nakrywkowym. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na noc. Następnego dnia przechowuj szkiełka w odpowiednim pudełku w temperaturze 4 stopni Celsjusza, uważając, aby uniknąć ekspozycji na światło.

Używając odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego lub mikroskopu konfokalnego, view przekroje. Uchwyć obrazy za pomocą kamery podłączonej do mikroskopu. Następnie użyj mikroskopu fluorescencyjnego lub mikroskopu konfokalnego, aby przeanalizować sygnały dodatnie w sekcjach, pod względem rozkładu przestrzennego i intensywności sygnału, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.