JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 4:57 min. • July 8th, 2025
Zacznij od funkcjonalizowanego glikochipa z wydrukowanymi podtablicami glikanów zorganizowanymi w bloki tablic
.Każde miejsce w podtablicy reprezentuje odrębny glikan — polimer na bazie węglowodanów z różnicami w składzie monosacharydów, długości łańcucha i wzorze rozgałęzień.
Potraktuj glikochip buforem blokującym, aby zablokować niespecyficzne miejsca interakcji.
Przenieś glikochip i wprowadź rozcieńczoną surowicę myszy do buforu uzupełnionego środkami powierzchniowo czynnymi, aby zminimalizować agregację przeciwciał. Inkubować pod wpływem mieszania.
Pobudzenie sprzyja równomiernemu rozprowadzaniu surowicy, ułatwiając selektywne wiązanie przeciwciał antyglikanowych z określonymi glikanami w oparciu o różne cechy molekularne.
Przemyć zmniejszającymi się stężeniami buforu zawierającego środek powierzchniowo czynny, aby zakłócić niespecyficzne wiązanie i wypłukać.
Nałożyć glikochip na przeciwciała drugorzędowe sprzężone z biotyną przeciwko myszy, oddziałujące z wstępnie związanymi przeciwciałami antyglikanowymi i przepłukać.
Wprowadzić streptawidynę znakowaną fluoroforem, wiążąc się z biotynylowanymi przeciwciałami drugorzędowymi. Umyj i usuń nadmiar roztworu.
Zeskanuj glikochip i obserwuj wyraźne plamki fluorescencji w różnych pozycjach, co sugeruje krążące przeciwciała specyficzne dla glikanów w surowicy.
Przygotuj bufor od #1 do bufora #4 zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby przygotować glikochipy i próbki, połóż pudełko do przechowywania ze szkiełkami na stole, aż osiągną temperaturę pokojową. Otwórz pudełko i przenieś glikochip do komory inkubacyjnej, która powinna być już kondycjonowana mokrą bibułą filtracyjną, aby utrzymać stałą wilgotność wewnątrz komory.
W międzyczasie rozcieńczyć serum myszy buforem 1 w 1,5-mililitrowych probówkach. Homogenizować roztwór surowicy przez 5 sekund za pomocą mieszalnika wirowego. Po homogenizacji inkubować rozcieńczoną surowicę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut w łaźni wodnej, aby uniknąć agregacji immunoglobulin. Następnie odwiruj probówki przez 3 minuty w temperaturze 10 000 razy g i 25 stopni Celsjusza.
Zebrać sklarowany nad osadem i wyrzucić wstrząśnięty materiał. Ostrożnie umieścić glikochip w komorze inkubacyjnej. Inkubuj go z 1 mililitrem buforu #3, aby wyeliminować wszelkie pozostałości materiału na powierzchni glikochipa. Przez 15 minut, w temperaturze 25 stopni Celsjusza, trzymaj glikochip w pozycji pionowej i przemyj go kilkoma kroplami buforu #3 za pomocą plastikowej pipety Pasteura.
Następnie ostrożnie usuń bufor z powierzchni glikochipa za pomocą bibuły filtracyjnej. Umieścić glikochip z powrotem w komorze inkubacyjnej. Rozprowadzić rozcieńczoną próbkę surowicy na powierzchni glikochipa za pomocą mikropipety. Upewnij się, że wszystkie suche obszary powierzchni glikochipa są pokryte rozcieńczoną próbką surowicy za pomocą końcówki pipety.
Inkubować z mieszaniem orbitalnym w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 1 i 1/2 godziny. Po inkubacji usunąć nadmiar próbki i zanurzyć glikochip na 5 minut w buforze #3 w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Przełóż glikochip do pojemnika z buforem #4, a na koniec umyj glikochip ultraczystą wodą.
Odwiruj glikochip przez 1 minutę w temperaturze 175 g i 25 stopni Celsjusza, aby usunąć płyn. Po umieszczeniu glikochipa z powrotem w komorze inkubacyjnej, rozprowadź roztwór koziego anty-mysiego sprzężonego z biotyną na powierzchni glikochipa. Inkubować z mieszaniem orbitalnym w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Usuń frakcję niezwiązaną i powtórz etapy mycia.
Po odwirowaniu inkubować glikochip w ciemności w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 45 minut z 2 mikrogramami na mililitr odpowiedniego roztworu streptawidyny znakowanego fluorochromem w buforze #2. Po pracy w ciemności w celu usunięcia frakcji niezwiązanej i powtórzeniu etapów mycia, wysuszyć glikochip powietrzem.
Aby zeskanować matrycę, pozostaw glikochip na stole, aż osiągnie temperaturę pokojową w ciemności. W tym samym czasie włącz skaner slajdów i laser. Trzymając mikromatrycę, wsuń glikochip do szczeliny, aż dotknie tyłu. Zeskanuj glikochip, uruchamiając narzędzie Easy Scan i zapisz skan jako plik .tiff.