JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 wyświetleń • 3:38 min • July 8th, 2025
Weź szkiełko z dołkami reakcyjnymi zawierającymi cienkie odcinki różnych tkanek roślinnych. Tkanki są utrwalane i zatapiane w żywicy w celu barwienia immunologicznego.
Umieść szkiełko w ciemnej i wilgotnej komorze inkubacyjnej, aby zapobiec ekspozycji na światło i parowaniu odczynnika podczas kolejnych etapów.
Wprowadzić roztwór blokujący, aby zapobiec nieswoistej interakcji przeciwciał.
Przemyć, aby usunąć nadmiar roztworu blokującego, a następnie dodać przeciwciała pierwszorzędowe specyficzne dla antygenu i inkubować.
Przeciwciała wiążą się z docelowymi antygenami, a mianowicie białkami arabinogalaktanu i pektynami w ścianie komórkowej.
Wprowadzić przeciwciała drugorzędowe sprzężone z fluoroforem, które wiążą się z przeciwciałami pierwszorzędowymi.
Umyć, aby usunąć niezwiązane przeciwciała i nałożyć barwnik fluorescencyjny, który wiąże się z celulozą, oznaczając ścianę komórkową.
Dodaj podłoże montażowe i uszczelnij szkiełkiem nakrywkowym.
Pod mikroskopem fluorescencja barwnika i związanych przeciwciał pomaga w wizualizacji celulozy w ścianach komórkowych roślin kolokalizowanych z białkami arabinogalaktanu lub pektynami, wykazując ich specyficzne dla tkanki rozmieszczenie.
Aby przygotować komorę inkubacyjną dla szkiełek reakcyjnych, umieść kilka zwilżonych ręczników papierowych na dnie pudełka z końcówkami do pipet i owiń pudełko folią aluminiową. Przenieś szkiełka z pudełka do komory inkubacyjnej. Odpipetować 50 mikrolitrów roztworu blokującego do każdej studzienki. Po inkubacji szkiełka przez 10 minut usunąć roztwór blokujący. Następnie umyj wszystkie studzienki dwukrotnie PBS przez 10 minut za każdym razem. Po przygotowaniu pierwotnych roztworów przeciwciał zgodnie z opisem w manuskrypcie, należy przeprowadzić końcowe płukanie studzienek destylowaną, dejonizowaną wodą przez 5 minut.
Odpipetować pierwszorzędowy roztwór przeciwciała do studzienek reakcyjnych. Następnie odpipetować roztwór blokujący do studzienek kontrolnych. Zamknąć komorę inkubacyjną. Odstaw na dwie godziny w temperaturze pokojowej, a następnie wstaw do lodówki na noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Przygotować 1% roztwór przeciwciała drugorzędowego w roztworze blokującym. Potrzebne będzie około 40 mikrolitrów na studzienkę.
Przykryj roztwór folią aluminiową. Przemyć studzienki szkiełka reakcyjnego dwukrotnie PBS i raz destylowaną, dejonizowaną wodą przez 10 minut za każdym razem. Upewnij się, że w studzienkach nie pozostał żaden roztwór blokujący ani osady. Odpipetować wtórny roztwór przeciwciała do wszystkich studzienek. Inkubuj szkiełka w ciemności w temperaturze pokojowej przez 3 do 4 godzin.
Ponownie umyć studzienki szkiełka reakcyjnego dwukrotnie PBS i raz destylowaną, dejonizowaną wodą. Następnie dodaj kroplę calcofluor-white do każdej studzienki. Bez mycia dodaj kroplę podłoża montażowego do każdej studzienki i przykryj każdą studzienkę szkiełkiem nakrywkowym. Obserwować skrawki próbki na szkiełku reakcyjnym za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
Do każdej obserwacji należy użyć filtra UV do wykrycia ścian komórkowych przebarwionych przez kalkofluor oraz filtra FITC do wykrycia immunolokalizacji. Aby uzyskać lepszą wizualizację wyników, użyj ImageJ lub podobnego programu do analizy obrazu, aby scalić każdy obraz filtra UV z odpowiadającym mu obrazem filtra FITC.