Za pomocą testu ELISA typu kanapkowego w celu określenia zawartości glikoproteiny immunogennej w szczepionce

Rozpocząć od pasywowanej płytki testowej pokrytej immunogennymi przeciwciałami monoklonalnymi specyficznymi dla glikoproteiny przeciwko wściekliźnie i środkiem blokującym, aby zapobiec niespecyficznym interakcjom.

Wprowadzić seryjnie rozcieńczoną referencyjną i testową szczepionkę przeciwko wściekliźnie o zmniejszającej się zawartości glikoproteiny. Uszczelnij płytę, aby zapobiec zanieczyszczeniu.

Podczas inkubacji glikoproteiny immunogenne oddziałują z powlekanymi przeciwciałami monoklonalnymi poprzez określone miejsce antygenowe.

Po inkubacji usuń folię, odessaj supernatant i umyj płytkę.

Nakładka z sprzężonymi z enzymami przeciwciałami monoklonalnymi specyficznymi dla glikoproteiny, które wiążą się z innym miejscem antygenowym na glikoproteinie, tworząc kompleks immunologiczny.

Dodaj roztwór zawierający substrat i chromogen. Kiedy substrat wchodzi w interakcję z enzymem, powoduje utlenianie chromogenu, zmieniając kolor roztworu.

Dodaj roztwór zatrzymujący, aby dezaktywować enzymy.

Zmierzyć absorbancję i wygenerować krzywą odniesienia, korzystając z wartości referencyjnych szczepionki.

Zidentyfikuj obszar, w którym istnieje liniowa zależność między absorbancją a zawartością glikoproteiny w referencyjnych rozcieńczeniach szczepionki. Następnie ekstrapolować zawartość glikoproteiny w rozcieńczeniach badanej szczepionki w oparciu o absorbancję mieszczącą się w tym regionie.

Aby umyć ostrze, dodaj 300 mikrolitrów buforu myjącego do każdej studzienki. Następnie ostrożnie odessać i przenieść zawartość studzienki do pojemnika zawierającego roztwór 2,6% podchlorynu sodu. Powtórz ten proces mycia jeszcze pięć razy, aby dokładnie umyć uczuloną płytkę.

Następnie odwróć mikropłytkę i pozostaw do wyschnięcia na kawałku chłonnego papieru w temperaturze pokojowej na jedną minutę. Odpuścić szczepionkę wzorcową w jednym mililitrze wody destylowanej tak, aby końcowe stężenie glikoproteiny wirusa wścieklizny wynosiło 10 mikrogramów na mililitr. Przygotować 10-krotne rozcieńczenie odtworzonej szczepionki referencyjnej w rozcieńczalniku, aby osiągnąć stężenie glikoproteiny wirusa wścieklizny wynoszące jeden mikrogram na mililitr.

Następnie należy wykonać sześć seryjnych dwukrotnych rozcieńczeń tej szczepionki referencyjnej w rozcieńczalniku, jak opisano w tabeli pierwszej protokołu tekstowego. Rozprowadzić 200 mikrolitrów rozcieńczalnika w zduplikowanych studzienkach, aby służyły jako ślepa kontrola, i 200 mikrolitrów na studzienkę dla każdego referencyjnego rozcieńczenia szczepionki w dwóch egzemplarzach.

Następnie należy przygotować 10-krotne rozcieńczenie badanej szczepionki w rozcieńczalniku i przygotować siedem dwukrotnych seryjnych rozcieńczeń badanej szczepionki w rozcieńczalniku, jak przedstawiono w tabeli drugiej protokołu tekstowego. Rozprowadzić 200 mikrolitrów każdego badanego rozcieńczenia szczepionki po dwóch egzemplarzach do każdej studzienki mikropłytki. Przykryj mikropłytkę folią samoprzylepną i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.

Następnie usuń folię, ostrożnie zaaspiruj i przenieś zawartość każdej studzienki do biorcy zawierającego 2,7% roztwór podchlorynu sodu. Aby umyć płytkę, dodaj 300 mikrolitrów buforu myjącego do każdej studzienki. Ostrożnie odessać i przenieść zawartość każdej studzienki do biorcy zawierającego 2,6% roztwór podchlorynu sodu.

Powtórz proces mycia jeszcze pięć razy, aby usunąć niezwiązany antygen i zachować trimery białka G związane z powlekanym przeciwciałem. Odwróć umytą mikropłytkę i pozostaw do wyschnięcia na kawałku chłonnego papieru w temperaturze pokojowej na jedną minutę. Następnie rozprowadzić 200 mikrolitrów zalecanego rozcieńczenia przeciwciała monoklonalnego D1 znakowanego peroksydazą w rozcieńczalniku do każdej studzienki.

Przykryj mikropłytkę folią samoprzylepną i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie usuń folię, ostrożnie odessaj i przenieś zawartość każdej studzienki do biorcy zawierającego 2,6% roztwór podchlorynu sodu. Aby umyć mikropłytkę, dodaj 300 mikrolitrów buforu myjącego do każdej studzienki.

Ostrożnie odessać i przenieść zawartość każdej studzienki do biorcy zawierającego 2,6% roztwór podchlorynu sodu. Powtórz ten proces mycia jeszcze pięć razy, aby usunąć niezwiązane przeciwciało znakowane peroksydazą. Odwróć mikropłytkę do mycia i pozostaw do wyschnięcia na kawałku chłonnego papieru w temperaturze pokojowej przez jedną minutę.

Następnie rozprowadź 200 mikrolitrów roztworu chromogenu substratu do każdej studzienki. Uszczelnij mikropłytkę folią i inkubuj w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut. Następnie dodaj 50 mikrolitrów roztworu zatrzymującego do każdej studzienki, aby zatrzymać reakcję.

Ostrożnie wytrzyj spód mikroostrza i umieść go w spektrofotometrze. Określ gęstość optyczną przy 492 nanometrach dla wszystkich użytych studzienek. Zbierz te dane w pliku arkusza kalkulacyjnego do analizy. Następnie należy utworzyć wykresy zarówno dla referencyjnej krzywej szczepionki, jak i wartości gęstości optycznej, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.