Name: Test organotypowy kolagenu I: plastyczna platforma do oceny zachowania komórek w kontekście trójwymiarowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Poznaj metodę organotypową z kolagenem I do badania migracji komórek nowotworowych i interakcji z fibroblastami w trójwymiarowym środowisku. Technika umożliwia analizę inwazji i przerzutów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Ustanowienie kultur fibroblastów z eksplantów skóry
<ol>
	<li>Biopsjey wycinane o średnicy 4 mm pobrane z przedramienia człowieka umieszcza się w pożywce MEM uzupełnionej o 100 units / ml penicyliny, 100 μg / ml streptomycyny oraz 0,25 μg / ml Fungizone.</li>
	<li>Należy odciąć tkankę tłuszczową podskórną i drobno posiekać biopsjat na małe kawałki, przesuwając ostrze skalpela nr 24 o dnie szalki Petriego.</li>
	<li>Zawiesinę tkankową przenosi się do kolby hodowlanej o powierzchni 25 cm2 z dodatkiem pożywki do wzrostu pierwotnych fibroblastów (MEM uzupełnione o 10% FCS, 100 units / ml penicyliny, 100 μg / ml streptomycyny oraz 25 μg / ml Fungizone) w ilości takiej, aby powierzchnia kolby była pokryta, lecz głębokość cieczy była niewystarczająca, by tkanka mogła pływać.</li>
	<li>Po 3 dniach inkubacji w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 należy dodać 3 ml pożywki do wzrostu pierwotnych fibroblastów.</li>
	<li>Po kolejnych 3 dniach inkubacji należy wymienić pożywkę na świeżą pożywkę do wzrostu pierwotnych fibroblastów; jeśli komórki są niemal konfluentne, można je przesiać w stosunku 1:4 do świeżej pożywki. (Od tego momentu można pominąć dodawanie Fungizone).</li>
</ol>
2. Etap I - Przygotowanie kolagenu I z ogonów szczura
Uwaga: Protokół dla około 12-14 ogonów szczurów młodzieńczych (świeżych lub mrożonych)
<ol>
	<li>Przygotuj ogon szczura, myjąc go w 70% etanolu, a następnie usuń ścięgna w następujący sposób:</li>
	<li>Usuń skórę z ogona szczura, nacinając go skalpelem w połowie długości od góry do dołu i ściągając skórę wzdłuż ogona.</li>
	<li>Oddziel ścięgno od rdzenia w części proksymalnej ogona.</li>
	<li>Usuń ścięgno w kierunku części dystalnej ogona, unikając uszkodzenia pochewki, używając pęsety ząbkowej.</li>
	<li>Ekstrahuj 1 g ścięgna w 250 ml 0,5 M kwasu octowego, mieszając przy 4°C przez 48 h.</li>
	<li>Odwiruj ekstrakt (7 500 x g) przez 30 min i odrzuć osad.</li>
	<li>Dodaj do supernatantu równą objętość 10% (w/v) NaCl i mieszaj przez 30-60 min.</li>
	<li>Odwiruj (10 000 x g) przez 30 min, odrzuć supernatant i ponownie rozpuść osad w 0,25 M kwasie octowym w stosunku ok. 1:1, mieszając przez 24 h przy 4°C.</li>
	<li>Dializuj roztwór kolagenu przeciwko 6-8 zmianom 6 L ok. 17,5 mM kwasu octowego (1 ml octanu lodowatego na litr zimnej wody, zmieniać 2 x dziennie).</li>
	<li>Odwiruj zdializowany kolagen przy 30 000 x g przez 1,5 h.</li>
	<li>Usuń supernatant i przelej do sterylnej kolby.</li>
	<li>Dostosuj stężenie kolagenu I do poziomu ok. 2 mg/ml, używając 0,5 mM kwasu octowego przy 4°C.</li>
</ol>
3. Etap II - Przygotowanie macierzy 3D z zatopionymi fibroblastami (pozostawienie do kurczenia przez 8 dni).
<ol>
	<li>Przygotować mieszaninę, używając zimnych odczynników w temperaturze 4°C w uprzednio schłodzonej butelce. Kolagen I przechowywać w lodzie.</li>
	<li>Dla jednej kolby T75 z konfluentnymi pierwotnymi fibroblastami (liczba komórek ok. 1 x 106) użyć:
	<ul>
		<li>25 ml kolagenu z ogona szczura (stężenie ok. 2mg/ml)</li>
		<li>3 ml 10xMEM</li>
		<li>0.22 M NaOH: najpierw dodać 2ml, następnie dodawać kroplowo podczas mieszania, aż kolagen zmieni kolor na pomarańczowy,</li>
		<li>ale nie na różowy (zazwyczaj do 3 ml). Przybliżone pH = 7.2.</li>
		<li>Uwaga: Ważne jest, aby upewnić się, że medium/żel pozostaje obojętny lub lekko kwaśny, ponieważ fibroblasty nie spowodują skurczu żelu w warunkach nawet lekko zasadowych.</li>
	</ul>
	</li>
	<li>Poddać fibroblasty trypsynizacji, wirować przy 400 x g przez 5 min i usunąć nadsącz.</li>
	<li>Podczas powyższego 5-minutowego wirowania: przygotować 12 plastikowych szalek o średnicy 35 mm – zazwyczaj z jednej kolby fibroblastów i mieszaniny kolagenu otrzymuje się 12 szalek.</li>
	<li>Resuspendować fibroblasty w 3 ml FCS, natychmiast dodać do mieszaniny kolagenu i wymieszać.</li>
	<li>Nanieść jak najszybciej około 2.5 ml kolagenu z fibroblastami na każdą szalkę. Unikać powstawania pęcherzyków powietrza i przedwczesnego żelowania kolagenu.</li>
	<li>Pozostawić kolagen do stężenia w temperaturze 37°C w uwilgotnionej atmosferze z 5% CO2 w powietrzu przez 10 min.</li>
	<li>Dodać 1ml pożywki do wzrostu fibroblastów (DMEM+ 10% FCS).</li>
	<li>Odczepić macierz kolagenowo-fibroblastyczną od ścianek szalki za pomocą pipety.</li>
	<li>Następnego dnia: dodać 1ml pożywki do wzrostu fibroblastów (DMEM + 10% FCS).</li>
	<li>Wymieniać pożywkę co drugi dzień. Pozostawić macierz kolagenowo-fibroblastyczną do skurczenia się przez około 8 dni, aż zmieści się w płytce 24-dołkowej (skurczenie z ok. 3.5 cm do 1.5 cm średnicy, patrz Rycina 1).</li>
</ol>
Uwaga: Stężenie kolagenu powinno zostać dostosowane do konkretnego zastosowania. Im bardziej rozcieńczony jest roztwór kolagenu, tym szybciej zostanie on obkurczony przez fibroblasty. W przypadku różnych partii kolagenu o tym samym stężeniu mogą wystąpić niewielkie różnice w tempie obkurczania. Podobnie, różne hodowle fibroblastów będą obkurczać żele kolagenowe z różną prędkością, a im więcej fibroblastów będzie obecnych, tym szybciej będzie przebiegał proces obkurczania. Z tego powodu stężenie kolagenu oraz gęstość fibroblastów można dostosować w celu modyfikacji tempa obkurczania oraz końcowej gęstości żelu kolagenowego.
4. Etap II - Wysiewanie interesujących komórek na macierz
Uwaga: Przed użyciem wysterylizuj wszystkie pęsety i sprzęt etanolem.
<ol>
	<li>Używając pęsety tępej, ostrożnie przenieś skurczoną macierz do płytki 24-dołkowej. Upewnij się, że nie uległa ona złożeniu.</li>
	<li>Przygotuj zawiesinę wybranych komórek o stężeniu około 4 x 104 /ml i nanieś 1ml (po trypsynizacji odwiruj komórki, aby usunąć trypsynę) na powierzchnię macierzy. Rzeczywista liczba potrzebnych komórek będzie różnić się w zależności od użytego typu komórek. Pożywka komórkowa powinna być standardową pożywką wzrostową dla badanych komórek.</li>
	<li>Pozostaw komórki do czasu osiągnięcia konfluencji na powierzchni macierzy, co trwa zazwyczaj około 3-5 dni.</li>
</ol>
5. Etap III - Przenoszenie macierzy na siatkę w celu inwazji (około 0-21 dni)
<ol>
	<li>Dotnij stalowe siatki, aby stworzyć statyw, a następnie wysterylizuj je w autoklawie przed użyciem (patrz Rysunek 2).</li>
	<li>Umieść sterylną siatkę w szalce 6 cm, dodaj pożywkę do poziomu powyżej siatki (ok. 10,5 ml). Połóż macierz na siatce i delikatnie odessaj pożywkę tak, aby spód macierzy stykał się z cieczą, ale nie był w niej zanurzony. Jest to tzw. interfejs powietrze/ciecz, który tworzy gradient sprzyjający inwazji. Wymieniaj pożywkę co dwa dni (patrz Rysunek 2).</li>
	<li>Obrazowanie kontekstowe żywych komórek z użyciem komórek fluorescencyjnych można przeprowadzić na tym etapie lub wcześniej. Skurczony lub włóknisty kolagen I można obrazować z wykorzystaniem generacji drugiej harmonicznej (SHG, patrz Rysunek 3). Stosując wzbudzenie wielofotonowe w połączeniu z detekcją szerokopolową, ustalono, że SHG można obrazować na głębokości co najmniej 100 μm w macierzy, podczas gdy komórki wykazujące ekspresję cytoplazmatycznego GFP można obrazować na głębokości co najmniej 200 μm.</li>
</ol>
Uwaga: W odniesieniu do ilościowej oceny inwazji, dzień umieszczenia macierzy na siatkach definiuje jako Dzień 0. Umieszczenie na siatkach generuje gradient pożywki hodowlanej, który sprzyja inwazji do macierzy. Próbki mogą być obrazowane w ciągu kolejnych 1 - 21 dni (lub dłużej), aby ocenić procesy biologiczne, takie jak inwazja, proliferacja, przeżywalność lub różnicowanie (Patrz lista referencyjna).
6. Etap IV - Fixacja
<ol>
	<li>Do probówki typu Falcon należy dodać 5 ml 4% PFA.</li>
	<li>Przenieść macierz na płaską powierzchnię. Przeciąć macierz na pół za pomocą nowego, czystego skalpela (ponieważ barwienie będzie wykonywane w przekroju poprzecznym), podnieść macierz skalpelem i przenieść do 4% PFA, pozostawiając do utrwalenia na noc.</li>
	<li>Macierze organotypowe są teraz gotowe do barwienia wybranym przeciwciałem lub barwnikiem (patrz Rycina 3).</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki:
<img alt="Proces kurczenia kolagenu przez fibroblasty; żel z fibroblastami kurczący się w ciągu 6-8 dni, układ eksperymentalny." src="/files/ftp_upload/3089/3089fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1 Przykład kurczenia kolagenu typu I przez fibroblasty. Mieszanina fibroblastów i kolagenu z ogona szczura, oddzielona od płytki Petriego i pozostawiona do skurczenia w ciągu 6-8 dni.
<img alt="Schemat testu organotypowego i przygotowanie szalki Petriego do badania inwazji komórek nowotworowych i oddziaływań z fibroblastami." src="/files/ftp_upload/3089/3089fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2 Przebieg analizy organotypowej. A, schemat układu i przebiegu hodowli organotypowej. BPrzykład matrycy kolagenowej/fibroblastycznej na sterylnym sitku ze stali nierdzewnej w celu stworzenia interfejsu powietrze-ciecz.
<img alt="Histologia gruczolakoraka przewodowego trzustki: mutacja P53 w porównaniu z typem nieinwazyjnym; schemat analizy kolagenu." src="/files/ftp_upload/3089/3089fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3 Zastosowania testu organotypowego. A, B nieinwazyjne i inwazyjne komórki gruczolakoraka przewodowego trzustki (PDAC) naciekające w czasie w macierzy organotypowej. C żywy ekwiwalent skóry wykazujący warstwową strukturę naskórka na włóknistym, skurczonym przez fibroblasty komponencie dermy kolagenowej. D komórki czerniaka C8161 naciekające włóknisty, skurczony przez fibroblasty ekwiwalent dermy kolagenowej. E inwazyjne komórki PDAC (zielone) oddziałujące i naciekające fibroblasty (czerwone) w macierzy organotypowej. F inwazyjne komórki PDAC (zielone) oddziałujące z degradującą otaczającą macierzą zewnątrzkomórkową (fioletową) zwizualizowaną przy użyciu wielofotonowej generacji drugiej harmonicznej.

<ol><li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130, 601-610 (2007).</li>
<li>Edward, M., Gillan, C., Micha, D., Tammi, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+regulation+of+fibroblast+hyaluronan+expression%3A+a+mechanism+to+facilitate+tumour+growth+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Tumour regulation of fibroblast hyaluronan expression: a mechanism to facilitate tumour growth and invasion.</a> Carcinogenesis. 26, 1215-1223 (2005).</li>
<li>Patsialou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+human+breast+cancer+cells+in+vivo+requires+both+paracrine+and+autocrine+loops+involving+the+colony-stimulating+factor-1+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Invasion of human breast cancer cells in vivo requires both paracrine and autocrine loops involving the colony-stimulating factor-1 receptor.</a> Cancer Res. 69, 9498-9506 (2009).</li>
<li>Serrels, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+study+of+E-cadherin+and+membrane+dynamics+in+living+animals%3A+implications+for+disease+modeling+and+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time study of E-cadherin and membrane dynamics in living animals: implications for disease modeling and drug development.</a> Cancer Res. 69, 2714-2719 (2009).</li>
<li>Timpson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Regulation+of+RhoA+Activity+during+Pancreatic+Cancer+Cell+Invasion+Driven+by+Mutant+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Spatial Regulation of RhoA Activity during Pancreatic Cancer Cell Invasion Driven by Mutant p53.</a> Cancer Res. 71, 747-757 (2011).</li>
<li>Edward, M., Quinn, J. A., Pasonen-Seppanen, S. M., McCann, B. A., Tammi, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Methylumbelliferone+inhibits+tumour+cell+growth+and+the+activation+of+stromal+hyaluronan+synthesis+by+melanoma+cell-derived+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">4-Methylumbelliferone inhibits tumour cell growth and the activation of stromal hyaluronan synthesis by melanoma cell-derived factors.</a> Br. J. Dermatol. 162, 1224-1232 (2010).</li>
<li>Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+differentiation+characteristics+of+transformed+keratinocytes+from+mouse+and+human+skin+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Growth and differentiation characteristics of transformed keratinocytes from mouse and human skin in vitro and in vivo.</a> J. Invest. Dermatol. 81, 168s-175s (1983).</li>
<li>Nystrom, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative+method+to+analyse+tumour+cell+invasion+in+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture.</a> J. Pathol. 205, 468-475 (2005).</li>
<li>Sabeh, F., Shimizu-Hirota, R., Weiss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease-dependent+versus+-independent+cancer+cell+invasion+programs%3A+three-dimensional+amoeboid+movement+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protease-dependent versus -independent cancer cell invasion programs: three-dimensional amoeboid movement revisited.</a> J. Cell. Biol. 185, 11-19 (2009).</li>
<li>Amjad, S. B., Carachi, R., Edward, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocyte+regulation+of+TGF-beta+and+connective+tissue+growth+factor+expression%3A+a+role+in+suppression+of+scar+tissue+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">Keratinocyte regulation of TGF-beta and connective tissue growth factor expression: a role in suppression of scar tissue formation.</a> Wound Repair Regen. 15, 748-755 (2007).</li>
<li>Gaggioli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast-led+collective+invasion+of+carcinoma+cells+with+differing+roles+for+RhoGTPases+in+leading+and+following+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells.</a> Nat. Cell. Biol. 9, 1392-1400 (2007).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

W niniejszej pracy przedstawiamy metodę wytwarzania macierzy trójwymiarowej odpowiedniej do badań migracji komórek inwazyjnych 6-8. Macierz składa się z włókien kolagenu typu 1, które są kurczone przez kilka dni przez pierwotne ludzkie fibroblasty naskórkowe. Kolagen jest przygotowywany poprzez ekstrakcję kwasową, a nie trawienie enzymatyczne, co pozwala zachować reaktywność na końcach polipeptydowych i sprzyja sieciowaniu włókien kolagenowych w większe agregaty po neutralizacji warunków buforu 9. Wynikiem jest zrekonstytuowany żel, który dokładniej naśladuje cechy kolagenu in vivo, co ma istotne znaczenie dla właściwości inwazyjnych komórek hodowanych w tych żelach. Nie ma znaczenia, czy użyty zostanie świeży, czy zamrożony materiał wyjściowy, jednak istotne jest wykorzystanie ogonów szczurów młodzieńczych, ponieważ sieciowanie kolagenu u młodszych zwierząt jest bardziej labilne. Kolagen I z młodszych zwierząt jest zatem łatwiejszy do ekstrakcji i rekonstytuuje się z większą wiernością.
Macierz kolagenową można utrwalić i barwić przeciwciałami skierowanymi przeciwko inwazyjnym komórkom nowotworowym lub fibroblastom zrazowym 2,10, co jest niezwykle przydatne przy badaniu skuteczności leków, które mogą hamować inwazję 5,6.
Choć niniejszy protokół sugeruje użycie pierwotnych ludzkich fibroblastów skóry, możliwe jest zastosowanie pierwotnych fibroblastów z innych typów tkanek, w zależności od rodzaju badanej tkanki. Możliwe jest również tworzenie kultur z użyciem fibroblastów unieśmiertelnionych, w tym komórek stabilnie transfekowanych koniugatami białek fluorescencyjnych. W ten sposób można znakować zarówno komórki zialne, jak i nowotworowe, aby zwizualizować interakcje międzykomórkowe podczas inwazji 11.

<table><tbody><tr><td>10x MEM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>21430</td><td>-</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>367176-500G</td><td>Przygotować roztwór zapasowy 0,22 M w wodzie</td></tr><tr><td>FCS</td><td>PAA Laboratories</td><td>A15-101</td><td>-</td></tr><tr><td>Szkiełka 35 mm</td><td>Falcon BD</td><td>353001</td><td>Do etapu 3.4</td></tr><tr><td>Szkiełka 60 mm</td><td>Falcon BD</td><td>353004</td><td>Do etapu 5.2</td></tr><tr><td>Pinceta sprężynowa tępa</td><td>Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific</td><td>E003/02</td><td>Ząbkowana, nie gładka</td></tr><tr><td>16% paraformaldehyd</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Rozcieńczyć do 4% w PBS przed użyciem</td></tr><tr><td>Sita do cd-1, rozmiar 40 mesh</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S07707-5EA</td><td>Siatki ze stali nierdzewnej, 5 szt. w opakowaniu</td></tr><tr><td>Rurki do dializy</td><td>Medicell International</td><td>7607 2295</td><td>12 - 14 kD</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Oxford Labware</td><td>BR0014G</td><td>-</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242853</td><td>-</td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa</td><td>Falcon BD</td><td>353047</td><td>Do etapu 4.1</td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Invitrogen</td><td>15290018</td><td>-</td></tr></tbody></table>

organotypowy test z kolagenem typu i: elastyczna platforma do oceny zachowania komórek w kontekście trójwymiarowym

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Migracja komórek jest fundamentalna dla wielu aspektów biologii, w tym dla rozwoju, gojenia ran, odpowiedzi komórkowych układu odpornościowego oraz przerzutowania komórek nowotworowych. Migrację badano na szklanych pokrywkach, aby dynamika komórkowa była podatna na analizę za pomocą mikroskopii świetlnej. Stało się jednak jasne, że wiele aspektów migracji komórek zależy od cech lokalnego środowiska, takich jak jego elastyczność, skład białkowy i rozmiar porów, które nie są wiernie reprezentowane przez sztywne podłoża dwuwymiarowe, takie jak szkło i plastik 1. Co więcej, wykazano, że oddziaływanie z innymi typami komórek, w tym z fibroblastami zrębowymi 2 i komórkami odpornościowymi 3, odgrywa krytyczną rolę w promowaniu inwazji komórek rakowych. Badania na poziomie molekularnym coraz częściej wykazują, że dynamika molekularna, w tym odpowiedź na leczenie farmakologiczne, identycznych komórek różni się znacząco w porównaniu in vitro i in vivo 4.
W idealnym przypadku najlepiej byłoby badać migrację komórek w ich naturalnym kontekście w żywych organizmach, jednak nie zawsze jest to możliwe. Dlatego istotnymi pośrednikami eksperymentalnymi są systemy hodowli tkankowych, takie jak macierz pochodzenia komórkowego, matrigel, hodowle organotypowe (opisane w niniejszym materiale), eksplanty tkankowe, organoidy oraz ksenoprzeszczepy. Systemy te przybliżają pewne aspekty środowiska in vivo, ale są bardziej podatne na manipulacje eksperymentalne, takie jak wykorzystanie stabilnie transfektowanych linii komórkowych, schematy leczenia lekami oraz długoterminowe obrazowanie o wysokiej rozdzielczości. Takie systemy pośrednie są szczególnie użyteczne jako pola testowe do walidacji sond i ustalania parametrów niezbędnych do obrazowania dynamicznej odpowiedzi komórek i reporterów fluorescencyjnych przed przystąpieniem do obrazowania in vivo 5. W związku z tym mogą one odgrywać istotną rolę w ograniczaniu zapotrzebowania na eksperymenty na żywych zwierzętach.

Opisano metodę przygotowania trójwymiarowej macierzy składającej się z kolagenu typu I oraz pierwotnych ludzkich fibroblastów. Ten żel organotypowy służy jako przydatny substrat do oceny inwazyjnej migracji komórek, ponieważ naśladuje podstawowe cechy stromy tkanki i nadaje się do wielu form mikroskopii.

Organotypowy test z kolagenem typu I: elastyczna platforma do oceny zachowania komórek w kontekście trójwymiarowym

Migracja komórek jest fundamentalna dla wielu aspektów biologii, w tym dla rozwoju, gojenia ran, odpowiedzi komórkowych układu odpornościowego oraz...

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie trójwymiarowej macierzy kolagenowej przypominającej tkankę w celu badania funkcji komórek. Osiąga się to poprzez wstępne wyekstrahowanie kolagenu z ścięgien ogonów szczurzych. Następnie włókna kolagenowe są rekonstruowane w obecności fibroblastów, aby umożliwić tym komórkom kurczenie żelu kolagenowego.W trzecim etapie, w ostatnim kroku, komórki nowotworowe są osadzane na powierzchni macierzy. Macierz inkubuje się na metalowej siatce, aby stworzyć granicę faz powietrze-ciecz, co umożliwia inwazję komórek nowotworowych do wnętrza macierzy. Ostatecznie można przeprowadzić barwienie immunohistochemiczne i mikroskopię fluorescencyjną w celu analizy syntezy macierzy oraz migracji komórek, w tym inwazji komórek nowotworowych i oddziaływań między różnymi typami komórek.Ta metoda jest zatem idealnie dostosowana do badania inwazji i przerzutowania, a także rozwoju nowotworu. W złożonym układzie trójwymiarowym możemy analizować takie procesy jak różnicowanie, przeżywalność oraz wzrost komórek. W szczególności możemy badać, w jaki sposób komórki nowotworowe oddziałują ze stromą podczas kluczowych etapów inwazji.Jednym z najwcześniejszych etapów przerzutowania nowotworu jest ustanowienie kultur fibroblastów z implantów skóry. Najpierw należy nanieść kilka kropli pożywki MEM uzupełnionej o penicylinę, streptomycynę i fungizone na dno szalki Petriego. Następnie do szalki należy umieścić wycinki skóry o średnicy 4 mm, pobrane metodą punch biopsy z przedramienia człowieka.Następnie, w ostatnim kroku, posiekaj biopsjat na małe kawałki, przesuwając ostrze skalpela nr 24 o dno szalki Petriego. Przenieś zawiesinę tkankową do kolby do hodowli tkanek o powierzchni 25 cm². Następnie zalej tkankę pożywką do wzrostu pierwotnych fibroblastów.Jest to wystarczająca ilość, aby pokryć powierzchnię kolby, lecz niewystarczająca, by tkanka mogła swobodnie pływać. Inkubuj kolbę przez trzy dni w temperaturze 37 °C w humidyfikowanej atmosferze z 5% CO2, a następnie, po kolejnych trzech dniach inkubacji, dodaj trzy mililitry podstawowej pożywki do wzrostu fibroblastów. Wymień pożywkę na świeżą podstawową pożywkę do wzrostu fibroblastów.Jeśli komórki są prawie konfluentne, można je przesiać w stosunku od 1:2 do 1:4 do nowych kolb ze świeżą pożywką. Rozpocząć należy od przemycia ogonów szczura w 70% Ethanol, a butelkę 0,5 molarnego kwasu octowego schłodzić do temperatury four degrees Celsius, aby usunąć ścięgna z ogonów szczura. W pierwszej kolejności należy zdjąć skórę z każdego ogona szczura.Następnie odseparuj ścięgno od rdzenia proksymalnej części ogona. Na koniec, za pomocą pęsety dentystycznej, usuń ścięgno w kierunku dystalnej części ogona. Po usunięciu ścięgien wlej 250 mililitrów 0,5 molarnego kwasu octowego do szklanej kolby stożkowej.Wyekstrahuj jeden gram ścięgna na 250 ml kwasu, mieszając w temperaturze 4°C przez 48 godzin po wyjęciu ścięgna. Odwiruj roztwór kwasu i ścięgna przy 7 500 ×g przez 30 minut w temperaturze 4°C, a następnie odrzuć osad. Następnie dodaj do supernatantu taką samą objętość 10% (w/v) NaCl i mieszaj przez kolejne 30 do 60 minut po drugim etapie mieszania.Odwiruj roztwór. Tym razem przy 10 000 ×g, odlej supernatant i ponownie rozpuść osad w 0,25 M kwasie octowym, mieszając przez kolejne 24 godziny w temperaturze 4 °C. Następnie poddaj roztwór kolagenu dializie przeciwko sześciu do ośmiu zmianom 6 litrów około 17,5 mM kwasu octowego.Po dializie odwiruj kolagen z prędkością 30 000 ×g przez 1,5 godziny. Następnie przenieś nadnadcantidad do sterylnej butelki i dostosuj stężenie kolagenu do około 2 mg/mL, używając wcześniej schłodzonego 0,5 mM kwasu octowego, a następnie przechowuj kolagen na lodzie. W pierwszej kolejności wybierz trzy kolby T75 z konfluencyjnymi pierwotnymi fibroblastami.Umieść pojemnik z FCS w temperaturze 4 °C w celu schłodzenia. Następnie dodaj 75 ml wcześniej przygotowanego kolagenu z ogona szczura do 100 ml sterylnej, uprzednio schłodzonej butelki szklanej. Następnie dodaj 9 ml 10 XMEM, mieszając zawiesinę.Dodaj sześć mililitrów 0,22 N wodorotlenku sodu, zwalniając przy dodawaniu ostatniego mililitra, aby upewnić się, że końcowy kolor znajduje się pomiędzy pomarańczowym a różowym. Potraktuj fibroblasty trypsyną, a następnie odwiruj komórki w celu otrzymania osadu przy 400 ×g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Podczas wirowania przygotuj plastikowe płytki 35 mm. Przesuś osad w 10 ml schłodzonej wcześniej FCS i bezzwłocznie dodaj fibroblasty do kolagenu. Wymieszaj i rozlej około 2,5 ml mieszaniny kolagenu z fibroblastami na każdą płytkę 35 mm tak szybko, jak to możliwe.Należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza oraz przedwczesnego żelowania kolagenu. Płytki należy umieścić w inkubatorze na 10 minut, aby kolagen mógł utworzyć luźny żel, a następnie dodać 1 ml pożywki do wzrostu fibroblastów do każdej płytki. Następnie, za pomocą pipety, należy odkleić macierz kolagenową fibroblastów od ścianek płytki i ponownie umieścić płytki w inkubatorze.Następnego dnia do naczyń należy dodać kolejny mililitr pożywki wzrostowej Fiberblast. Następnie należy wymieniać pożywkę co drugi dzień przez kolejne około osiem dni. W tym czasie każda macierz kolagenowa fibroblastów powinna skurczyć się z około 3,5 centymetrów do około 1,5 centymetrów średnicy; przed rozpoczęciem kolejnego kroku należy wysterylizować wszystkie pęsety i sprzęt etanolem.Następnie, używając sterylnej pęsety o tępym zakończeniu, delikatnie przenieś skurczoną macierz do dołka płytki 24-dołkowej, dbając o to, aby macierz się nie zagięła. Następnie wybierz kolbę z komórkami przeznaczonymi do badania, zaspiruj nadmiar pożywki i sypnij komórki w taki sam sposób jak poprzednio, a następnie resuspenduj komórki w pożywce. Nanieś jeden mililitr zawiesiny komórkowej na wierzch macierzy i umieść skurczoną macierz w inkubatorze, aż komórki urosną prawie do pełnej konfluencji na górnej powierzchni macierzy. Około trzy do pięciu dni po autoklawowaniu wstępnie dociętych stalowych siatek do tworzenia trójnogów, przed użyciem umieść sterylną siatkę w plastikowej szalce o średnicy sześciu centymetrów i dodaj wystarczającą ilość pożywki wzrostowej, aby pokryła siatkę.Utworzenie granicy faz powietrze-ciecz jest najdelikatniejszym etapem tej procedury. Matrycę należy umieścić na siatce, a następnie ostrożnie odessać pożywkę w taki sposób, aby matryca pozostała częściowo zanurzona od dołu i była z tej strony nawadniana. Tworzy to gradient chemotaktyczny i pozwala komórkom znajdującym się na górze rozpocząć inwazję do wnętrza matrycy.Zachowanie komórek w tej konfiguracji można następnie oceniać przez 21 dni lub dłużej. Umieść matrycę na siatce. Następnie ostrożnie odessaj medium, aż dół matrycy znajdzie się w kontakcie z medium, ale nie będzie przez nie przykryty.Interfejs powietrze-ciecz powinien wyglądać teraz podobnie do widocznej tutaj sceny. Następnie przenieś infiltrowaną macierz na płaską powierzchnię. Przeciąć macierz na pół nowym skalpelem, a następnie podnieść ją skalpelem i przenieść do 4% PFA.Utrwal macierz przez noc w temperaturze pokojowej. Na następnych dwóch rysunkach komórki gruczolakoraka przewodowego trzustki lub komórki P DAC zostały naniesione na macierz organotypową. Na pierwszym rysunku widoczne są nieinwazyjne komórki P dac w warstwie na powierzchni macierzy, natomiast na drugim rysunku obserwuje się inwazyjne komórki P dac, które infiltrowały macierz. Tutaj widoczny jest żywy ekwiwalent skóry z warstwowym naskórkiem na skurczonym przez fibroblasty kolagenowym komponencie skórnym. Inwazyjne komórki PD w kolorze zielonym oddziałują z fibroblastami w kolorze czerwonym, które promują inwazję komórek PDX do macierzy organotypowej.Inwazyjne komórki PD, ponownie pokazane tutaj na zielono, są uwidocznione wewnątrz macierzy kolagenowej, obrazowanej za pomocą generowania drugiej harmonicznej; w kolorze fioletowym widoczne są miejsca degradacji macierzy w postaci ciemnych otworów w fioletowej strukturze. Na rysunku C 8 1 61 przedstawiono komórki czerniaka naciekające skurczony przez fibroblasty kolagenowy ekwiwalent skóry, a także analizę zachowania podstawowych procesów białek fluorescencyjnych podczas tego testu. Metodę tę można również stosować wraz z barwieniem immunohistochemicznym w celu oceny markerów proliferacji komórek, różnic w przeżywalności komórek itp.

organotypic-collagen-i-assay-malleable-platform-to-assess-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Test kolagenu I organotypowy: elastyczna platforma do oceny zachowania komórek w kontekście trójwymiarowym

Eksplanty z układu dopaminergicznego śródmózgowia oraz prążkowia są wykorzystywane w teście z matrycą kolagenową do analizy in vitro rozwoju szlaków mezostriatalnych i striatonigralnych. W tym teście wzrost i prowadzenie aksonów mogą być manipulowane oraz kwantyfikowane. Metodę tę można również zmodyfikować w celu oceny innych obszarów lub sygnałów molekularnych.

Disekcja i hodowla eksplantów dopaminergicznych i prążkowiowych myszy w trójwymiarowych testach w matrycy kolagenowej

Ten artykuł przedstawia metodę fluorescencyjnego znakowania kolagenu, która może być dalej wykorzystywana zarówno do obrazowania na żywo, jak i do obrazowania na żywo kultur komórkowych 3D. Zapewniamy również zoptymalizowany protokół wizualizacji endogennych białek cytoszkieletu komórek hodowanych w środowiskach 3D.

Odkrywanie organizacji cytoszkieletu inwazyjnych komórek nowotworowych w 3D

Migracja komórek to zjawisko biologiczne, które bierze udział w wielu procesach fizjologicznych, takich jak gojenie się ran i reakcje immunologiczne oraz procesy patofizjologiczne, takie jak rak. Test migracji macierzy kolagenu 3D jest wszechstronnym narzędziem do analizy właściwości migracyjnych różnych typów komórek w środowisku fizjologicznym 3D.

Analiza migracji komórek w obrębie trójwymiarowej matrycy kolagenowej

Właściwości mechaniczne i mikrostruktura macierzy zewnątrzkomórkowej silnie wpływają na migrację komórek w 3D. Opisano metodę in vitro do badania czasoprzestrzennego zachowania migracji komórek w zmiennych biofizycznie środowiskach, zarówno na poziomie populacji, jak i poszczególnych komórek.

Koncentryczny system żelowy do badania biofizycznej roli mikrośrodowiska macierzy w migracji komórek 3D

Kolagen jest kluczowym składnikiem ECM i dostarcza niezbędnych wskazówek dla kilku procesów komórkowych, począwszy od migracji, a skończywszy na różnicowaniu i proliferacji. Poniżej przedstawiono protokół osadzania komórek w hydrożelach kolagenowych 3D oraz bardziej zaawansowaną technikę generowania losowych lub wyrównanych matryc kolagenowych przy użyciu mikrokanałów PDMS.

Przygotowanie żeli kolagenowych 3D i mikrokanalików do badania oddziaływań 3D in vivo

Ten manuskrypt opisuje technikę opartą na miękkiej litografii, polegającą na inżynierii jednolitych układów trójwymiarowych (3D) tkanek nabłonkowych o określonej geometrii otoczonych macierzą zewnątrzkomórkową. Metoda ta jest dostosowana do szerokiej gamy typów komórek i kontekstów eksperymentalnych oraz pozwala na wysokoprzepustowe badania przesiewowe identycznych kontrprób.

Inżynieria trójwymiarowych tkanek nabłonkowych osadzonych w macierzy zewnątrzkomórkowej

Tutaj udostępniamy metodę analizy zachowania rosnących aksonów w matrycach 3D, naśladując ich naturalny rozwój.

Generowanie hydrożeli 3D na bazie kolagenu do analizy wzrostu i zachowania aksonów podczas rozwoju układu nerwowego

Ten protokół demonstruje użycie kanału mikroprzepływowego o zmieniającej się geometrii wzdłuż kierunku przepływu płynu do generowania naprężeń rozciągających (rozciągających) w celu wyrównania włókien w hydrożelu kolagenowym 3D (&lt;250 μm grubości). Wynikowe wyrównanie rozciąga się na kilka milimetrów i ma na nie wpływ szybkość odkształcania rozciągającego.

Mikroinżynieryjne hydrożele kolagenowe 3D z wyrównaniem włókien dalekiego zasięgu

Tutaj prezentujemy protokół hodowli komórek IDG-SW3 w trójwymiarowej (3D) macierzy zewnątrzkomórkowej.

Hodowla komórkowa IDG-SW3 w trójwymiarowej macierzy zewnątrzkomórkowej

Protokół ten określa generowanie organoidów z komórek nabłonka pęcherzykowego A549 oraz fibroblastów płuc MRC-5 na rusztowaniu hydrożelowym z macierzy zewnątrzkomórkowej, a następnie osadzenie w żelach kolagenowych 3D oraz ekspozycję na mechaniczne obciążenia za pomocą bioreaktora rozciągającego komórki do badania mechanobiologii pęcherzykowej.

Generowanie trójwymiarowych organoidów pęcherzykowych A549/MRC-5 z wykorzystaniem mechanicznego bioreaktora rozciągającego komórki

Poznaj metodę organotypową z kolagenem I do badania migracji komórek nowotworowych i interakcji z fibroblastami w trójwymiarowym środowisku. Technika umożliwia analizę inwazji i przerzutów.

Organotypowy test z kolagenem typu I: elastyczna platforma do oceny zachowania komórek w kontekście trójwymiarowym

Przeglądaj więcej filmów