Technika wykrywania szczepów sinic za pomocą chipa mikromacierzy przeciwciał

Zacznij od chipa mikromacierzy przeciwciał z wydrukowanymi specyficznymi przeciwciałami.

Każda plamka zawiera unikalne przeciwciało przeciwko określonemu szczepowi sinicy.

Traktuj chip za pomocą bufora blokującego, aby zminimalizować niespecyficzne interakcje.

Zmontuj chip w kasecie hybrydyzacyjnej posiadającej wiele dołków.

Wprowadź próbkę środowiskową do studzienek i inkubuj ją w zoptymalizowanych warunkach.

Próbka zawiera różne bakterie, w tym różne szczepy cyjanobakterii, które oddziałują ze specyficznymi przeciwciałami na wydrukowanym chipie. Umyj chip, aby usunąć niezwiązane bakterie.

Dodać mieszaninę przeciwciał zawierającą znakowane fluoroforem przeciwciała szczepu anty-sinicowego oddziałujące ze specyficznymi antygenami na odpowiednich komórkach sinic. Usuń niezwiązane przeciwciała.

Zdemontuj kasetę, umyj i osusz chip, a następnie zeskanuj go.

Fluorescencja w określonych miejscach oznacza obecność określonych szczepów sinic w próbce.

Ustaw szkiełko w kasecie hybrydyzacyjnej mikromacierzy o wymiarach 3 na 8 dołków, postępując zgodnie z instrukcjami dostawcy. Alternatywnie, po zmodyfikowaniu wzoru drukowania przeciwciał, skonfiguruj niestandardową kasetę, taką jak ta pokazana tutaj, lub po prostu użyj slajdów okładkowych do konfiguracji.

Po zmontowaniu szkiełka i kasety należy odpipetować do 50 mikrolitrów każdej próbki ekstraktu lub rozcieńczyć ją w buforze inkubacyjnym do ekstrakcji do każdej studzienki kasety. Alternatywnie, załaduj próbki do innych urządzeń inkubacyjnych lub po prostu użyj szkiełek podstawowych.

Jako ślepą próbę należy odpipetować 50 mikrolitrów buforu TBST-RR do co najmniej dwóch oddzielnych dołków kasety. Próbki należy inkubować w temperaturze otoczenia przez 1 godzinę i mieszać pipetując co 15 minut lub inkubować w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 12 godzin.

Aby umyć mikromacierze, odłóż kasetę i ostrożnie postukaj nią o czysty chłonny papier. Następnie umyj studzienki, dodając do każdej z nich 150 mikrolitrów buforu do inkubacji ekstrakcyjnej i usuń bufor, stukając w papier chłonny, jak poprzednio. Powtórz pranie jeszcze trzy razy.

Do każdej studzienki dodaj 50 mikrolitrów mieszaniny przeciwciał fluorescencyjnych, która zawiera 17 przeciwciał szczepu antycyjanobakteryjnego. Próbki należy inkubować w temperaturze otoczenia przez 1 godzinę lub w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 12 godzin.

Aby umyć mikromacierze, ostrożnie odłóż kasetę i delikatnie postukaj nią o czysty chłonny papier. Następnie dodaj 150 mikrolitrów buforu do inkubacji ekstrakcji przed usunięciem go przez stukanie w ręcznik papierowy. Powtórz pranie trzy razy. Następnie zdemontuj kasetę i zanurz szkiełko w roztworze 0,1x PBS w celu szybkiego spłukania. Szybko odwirować jak poprzednio, aby wysuszyć szkiełko.

Za pomocą skanera fluorescencyjnego zeskanuj szkiełko w poszukiwaniu fluorescencji przy maksymalnym piku emisji dla barwnika fluorescencyjnego dalekiej czerwieni. Wykonaj kilka zdjęć mikromacierzy przy różnych parametrach skanowania, zmieniając wartość wzmocnienia.