JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 wyświetleń • 3:39 min • July 8th, 2025
Weźmy płytkę wielodołkową zawierającą komórki ssaków zamknięte w systemie hydrożelowym naśladującym naturalne środowisko macierzy zewnątrzkomórkowej.
Usuń pożywkę hodowlaną. Potraktuj buforem utrwalającym, aby usieciować białka, zachowując integralność komórkową.
Dodaj roztwór zawierający detergent, aby przepuszczalnie błonę komórkową.
Wprowadzić roztwór blokujący, aby zapobiec wiązaniu się przeciwciał nieswoistych w kolejnych krokach.
Dodaj pierwszorzędowy koktajl przeciwciał, który wnika do komórek i wiąże się specyficznie z cytoplazmatycznymi włóknami pośrednimi i docelowym czynnikiem transkrypcyjnym.
Usunąć niezwiązane przeciwciała. Wprowadź znakowane fluorescencyjnie przeciwciała drugorzędowe i barwnik jądrowy, aby znakować DNA fluorescencyjnie.
Usuń niezwiązane cząsteczki.
Zamontuj kulturę hydrożelu na szkiełku za pomocą podłoża mocującego.
Użyj mikroskopu konfokalnego, aby obserwować komórki wybarwione immunologicznie.
Najpierw odessaj pożywkę z każdej studzienki. Następnie umyj studzienki 1 mililitrem ciepłego DPBS. Po zakończeniu mycia dodaj 750 mikrolitrów roztworu utrwalającego do każdej studzienki. Następnie inkubować 24-dołkową płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po inkubacji odessać roztwór utrwalający z każdej z studzienek i wyrzucić utrwalacz do pojemnika na odpady niebezpieczne. Następnie dodaj 1 mililitr DPBS do próbki i natychmiast wyrzuć DPBS do pojemnika na odpady niebezpieczne.
Następnie dodaj 750 mikrolitrów roztworu przepuszczalnego, aby przepuszczać próbkę przez godzinę w temperaturze pokojowej na wahaczu, z prędkością 15 obrotów na minutę. Po godzinie odessać roztwór przepuszczalny i dodać do próbki 750 mikrolitrów roztworu blokującego. Pozostawić próbkę na bujaku w temperaturze pokojowej na trzy godziny. Następnie rozcieńczyć pożądane przeciwciała pierwszorzędowe roztworem rozcieńczania przeciwciał.
Następnie dodaj 500 mikrolitrów roztworu przeciwciała do każdej próbki. Próbki należy inkubować przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnego dnia odessać roztwór przeciwciała pierwotnego. Następnie przemywać próbki PBST trzykrotnie przez jedną godzinę, w temperaturze pokojowej, przy 15 obrotach na minutę.
Następnie rozcieńczyć odpowiednie przeciwciała drugorzędowe i 5 mg/ml roztworu podstawowego DAPI, aby osiągnąć końcowe stężenie 2,5 mikrograma na mililitr. Następnie dodaj 500 mikrolitrów roztworu do każdej próbki. Następnie użyj folii aluminiowej, aby przykryć 24-dołkową płytkę i inkubować płytkę w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez noc.
Następnego dnia odessać roztwór przeciwciała drugorzędowego i trzykrotnie przemyć próbki PBST, każda przez 30 minut w temperaturze pokojowej na kołysce. Następnie umieść kroplę twardego podłoża montażowego na powierzchni szkiełka podstawowego i umieść próbkę na podłożu mocującym. Na koniec użyj lakieru do paznokci, aby uszczelnić próbki do szkiełka pokrywy, aby zapobiec zanieczyszczeniu lub ruchowi próbki.