Ocena wewnątrzkomórkowej dystrybucji koniugatów przeciwciał zmodyfikowanych peptydami pochodzącymi z wirusa

Zacznij od przylegających ludzkich komórek erytroblastów.

Wprowadź koniugaty przeciwciał pochodzących od wirusa, zmodyfikowane peptydami. Te koniugaty zawierają sekwencję lokalizacji jądrowej lub NLS wirusa oraz resztę kwasu cholowego.

Podczas inkubacji koniugaty przeciwciał oddziałują z receptorami na powierzchni komórki i internalizują się w endosomach.

Kwas cholowy w koniugacie pomaga uciec z kompartmentu endosomalnego, umożliwiając akumulację wewnątrzkomórkową, podczas gdy białka transportowe i NLS ułatwiają ich lokalizację jądrową.

Wprowadź trypsynę i bufor zawierający EDTA, aby odłączyć komórki i usunąć koniugaty związane z powierzchnią.

Dodaj podłoże wzbogacone serum, aby zahamować aktywność trypsyny.

Odwirować, aby zebrać komórki; utrwalić je i przepuszczalnie.

Wprowadzić dalekoczerwone przeciwciała drugorzędowe znakowane fluoroforem, wiążąc się z zlokalizowanymi koniugatami i przemyć.

Potraktuj jądrowym barwnikiem barwiącym.

Obserwuj pod mikroskopem konfokalnym i rejestruj obrazy na różnych głębokościach płaskich.

Po przetworzeniu obrazu komórka wykazuje małe zielone ogniska fluorescencyjne wewnątrz cytoplazmy i jądra, potwierdzając wewnątrzkomórkową dystrybucję koniugatów przeciwciał.

Potraktuj docelowe komórki TF-1a 200 nanomolowymi koniugatami przeciwciał kwasu 7G3-cholowego. Obejmują komórki poddane działaniu zmodyfikowanych kontrolnych przeciwciał monoklonalnych. Inkubować 5 x 10⁶ komórek antygenowo-dodatnich z koniugatami w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie usuń supernatant i użyj jednego mililitra lodowatego PBS, aby trzykrotnie przemyć komórki.

Dodaj świeżą pożywkę i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dodatkową godzinę. Następnie dodaj 0,5 mililitra PBS zawierającego 0,25% trypsyny i EDTA i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza do 30 minut. Następnie użyj 1,5 mililitra pożywki RPMI-1640 z 10% FBS, aby zneutralizować trypsynę.

Odwirować komórki w temperaturze 500 razy g przez pięć minut. Usuń supernatant i użyj 0,5 mililitra lodowatego PBS, aby ponownie trzykrotnie umyć komórki. Dodaj 0,5 mililitra 1% PFA i 1% sacharozy w PBS do komórek i umieść je na lodzie na 30 minut, aby je utrwalić.

Następnie użyj 0,5 mililitra lodowatego PBS, aby trzykrotnie umyć komórki i odwirować próbki w temperaturze 250 razy g przez pięć minut. Następnie dodaj 0,15% Triton X-100 w PBS do komórek i przepuszczalnie je na lodzie przez pięć minut. Następnie lodowatym PBS umyj komórki i powtórz wirowanie.

Zawieś komórki w 0,1 mililitra PBS zawierającego dwa mikrogramy na mililitr anty-mysiego drugorzędowego przeciwciała poliklonalnego Fc sprzężonego z AlexaFluor 647 i inkubuj próbki w ciemności w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Odwiruj komórki w temperaturze 250 razy g przez pięć minut i użyj 0,5 mililitra lodowatego PBS do trzykrotnego umycia komórek.

Następnie ponownie zawieś ogniwa w 0,5 mililitra PBS. Dodaj 10 mikrogramów na mililitr jodku propidyny do komórek. Następnie za pomocą podłoża montażowego zamontuj 1 x 10⁵ komórek na szkiełkach podstawowych przed przykryciem próbki szklanym szkiełkiem nakrywkowym. Zbadaj komórki za pomocą obiektywu zanurzeniowego Plan Apo 60X, apertura numeryczna 1,42, na odwróconym laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym.

Wykrywanie fluorescencji PI za pomocą 488-nanometrowego lasera argonowego i spektralnego pryzmatu skanującego ustawionego na 600 do 650 nanometrów. Do fluorescencji AF 647 należy użyć lasera helowo-neonowego 633 nm i zestawu pryzmatów skaningowych spektralnych dla 650 do 700 nanometrów. Zbieraj obrazy z P1 i AF 647 sekwencyjnie, 1024 na 1024 piksele z 2-krotnym uśrednianiem linii wykonanym w odstępach 0,5 mikrona na całej grubości komórki. Prezentuj obrazy jako projekcje Z.

Aby przeanalizować komórki, oceń i zapisz, czy fluorescencja wewnątrzkomórkowa w cytoplazmie jest zgrupowana i blisko powierzchni komórki, czy rozproszona i jednorodna. Oceń również względną intensywność fluorescencji na komórkę.