JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 5:27 min. • July 8th, 2025
Pobrać trzy próbki kultur neuronalnych hipokampa na szkiełkach nakrywkowych.
Wprowadź przeciwciała pierwszorzędowe, aby oznaczyć receptory glutaminianu o ekspresji powierzchniowej.
Dodać kondycjonowaną pożywkę do drugiej i trzeciej próbki, aby wywołać endocytozę receptorów związanych z przeciwciałami.
W trzeciej próbce dodaj fragmenty Fab, aby zablokować epitopy na przeciwciałach nieendocytozowanych.
Wprowadź inhibitor, aby zablokować endocytozę receptora, jednocześnie umożliwiając recykling receptora na powierzchnię.
We wszystkich próbkach utrwal komórki i dodaj roztwór blokujący, aby zapobiec niespecyficznemu etykietowaniu.
Wprowadź przeciwciała drugorzędowe znakowane fluoroforem, aby oznaczyć przeciwciała pierwszorzędowe na receptorach związanych powierzchniowo, w tym przeciwciała pochodzące z recyklingu.
Przepuszczalność błon komórkowych.
Ponownie dodać przeciwciało pierwszorzędowe do pierwszej próbki, aby oznaczyć istniejące wcześniej receptory endocytozowane.
Wprowadź różne przeciwciała drugorzędowe znakowane fluoroforem do wszystkich próbek, aby oznaczyć przeciwciała pierwszorzędowe związane z endocytozowanym receptorem, rozróżniając receptory endocytozowane i związane powierzchniowo.
Za pomocą mikroskopu konfokalnego określ ilościowo receptory wyrażane powierzchniowo, endocytozowane i poddane recyklingowi w różnych terapiach.
Aby rozpocząć tę procedurę, przenieś szkiełka nakrywkowe stroną komórkową do góry na tacę pokrytą folią parafinową, aby zaoszczędzić odczynniki i ułatwić manipulację. Przechowuj i utrzymuj kondycjonowane podłoże w temperaturze 37 stopni Celsjusza na etapie inkubacji i mycia.
Inkubować komórki z pierwszorzędowymi przeciwciałami rozcieńczonymi w kondycjonowanym podłożu w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Następnie za pomocą pipety próżniowej ostrożnie odessać pożywkę zawierającą przeciwciała i trzykrotnie umyć komórki kondycjonowaną pożywką.
Jeśli badasz ekspresję receptora powierzchniowego w porównaniu z ekspresją receptora wewnątrzkomórkowego, utrwal komórki za pomocą paraformaldehydu po tym kroku, jak opisano w protokole tekstowym. Utrzymuj komórki w kondycjonowanym podłożu bez przeciwciał i zwróć je do inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby umożliwić internalizację. Jeśli badasz proces internalizacji, utrwal komórki paraformaldehydem po tym kroku, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Aby zablokować epitopy na pierwotnym przeciwciałie przyłączonym do receptorów o ekspresji powierzchniowej, które nie zostały zinternalizowane, inkubuj komórki z niesprzężonymi fragmentami przeciwciała anty-IgG Fab rozcieńczonymi w kondycjonowanych pożywkach przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyj komórki trzykrotnie kondycjonowanym podłożem. Inkubować umyte studzienki z kondycjonowaną pożywką zawierającą 80 mikromolowych dynasorów w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby umożliwić recykling zinternalizowanych receptorów.
Po zakończeniu modyfikacji na żywych komórkach, umyj komórki raz PBS+. Dodaj do komórek roztwór 4% paraformaldehydu i 4% sacharozy w PBS i inkubuj w dygestorium w temperaturze pokojowej przez 7 do 8 minut, aby utrwalić komórki. Następnie umyj komórki trzykrotnie zwykłym PBS. Dodaj do komórek roztwór 10% normalnej surowicy koziej w PBS i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby zablokować niespecyficzne miejsca wiązania.
Następnie inkubuj komórki z fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w 3% NGS w PBS w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, aby znakować receptory znakowane pierwszorzędowymi przeciwciałami. Następnie umyj komórki trzykrotnie PBS.
Aby rozpocząć znakowanie receptorów wewnątrzkomórkowych, dodaj roztwór 0,25% Triton-X do PBS i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 do 10 minut, aby przepuszczalność komórek. Następnie blokuj 10% NGS w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Jeśli badasz powierzchnię w porównaniu z całością, inkubuj komórki z tym samym pierwotnym przeciwciałem, które użyto wcześniej, rozcieńczonym w 3% NGS w PBS w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, aby oznaczyć receptory wewnątrzkomórkowe.
Następnie umyj komórki trzykrotnie PBS. Oznaczyć drugim fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w 3% NGS w PBS w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Następnie umyj komórki trzykrotnie PBS. Najpierw delikatnie umieść szkiełka nakrywkowe, stroną z komórkami do dołu, na 12 do 15 mikrolitrach odpowiedniego nośnika montażowego do zamontowania komórek. Następnie zobrazuj komórki pod odpowiednim mikroskopem konfokalnym i przeanalizuj komórki zgodnie z opisem w protokole tekstowym.