Ocena napływu wapnia indukowanego przez receptor limfocytów T za pomocą barwnika wskaźnikowego wapnia
JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 8:14 min. • July 8th, 2025
Zacznij od zawiesiny mysich limfocytów T i wprowadź barwnik wskaźnikowy wapnia - ester indo-1-acetoksymetylowy.
Barwnik dostaje się do komórek, gdzie wewnątrzkomórkowe esterazy rozszczepiają grupę acetoksymetylową, tworząc nieprzepuszczalny dla błony Indo-1, który wykazuje wyraźną fluorescencję w formach bezwapniowych i związanych z wapniem.
Dodaj przeciwciała przeciwko receptorowi Fc, aby zablokować niespecyficzne miejsca interakcji.
Wprowadź przeciwciała znakowane fluoroforem do podzbiorów limfocytów T barwienia.
Usuń niezwiązane przeciwciała i zabarwij barwnikiem żywotności, który w różny sposób barwi żywe i martwe komórki.
W cytometrii przepływowej najpierw wykryj słabą fluorescencję żywych komórek i zidentyfikuj limfocyty T znakowane fluoroforem, a następnie zmierz fluorescencję Indo-1 w tych komórkach.
Leczenie przeciwciałami anty-CD3, które oddziałują z kompleksem receptora limfocytów T CD3 i aktywują szlaki sygnałowe limfocytów T, indukując napływ wapnia do cytozolu.
Barwnik Indo-1 oddziałuje z uwolnionymi jonami wapnia, zmieniając fluorescencję barwnika z niebieskiego na fioletowy.
Przesunięcie fluorescencji Indo-1 ze stanów bezwapniowych do stanów związanych z wapniem pot
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych