Ocena napływu wapnia indukowanego przez receptor limfocytów T za pomocą barwnika wskaźnikowego wapnia

Zacznij od zawiesiny mysich limfocytów T i wprowadź barwnik wskaźnikowy wapnia - ester indo-1-acetoksymetylowy.

Barwnik dostaje się do komórek, gdzie wewnątrzkomórkowe esterazy rozszczepiają grupę acetoksymetylową, tworząc nieprzepuszczalny dla błony Indo-1, który wykazuje wyraźną fluorescencję w formach bezwapniowych i związanych z wapniem.

Dodaj przeciwciała przeciwko receptorowi Fc, aby zablokować niespecyficzne miejsca interakcji.

Wprowadź przeciwciała znakowane fluoroforem do podzbiorów limfocytów T barwienia.

Usuń niezwiązane przeciwciała i zabarwij barwnikiem żywotności, który w różny sposób barwi żywe i martwe komórki.

W cytometrii przepływowej najpierw wykryj słabą fluorescencję żywych komórek i zidentyfikuj limfocyty T znakowane fluoroforem, a następnie zmierz fluorescencję Indo-1 w tych komórkach.

Leczenie przeciwciałami anty-CD3, które oddziałują z kompleksem receptora limfocytów T CD3 i aktywują szlaki sygnałowe limfocytów T, indukując napływ wapnia do cytozolu.

Barwnik Indo-1 oddziałuje z uwolnionymi jonami wapnia, zmieniając fluorescencję barwnika z niebieskiego na fioletowy.

Przesunięcie fluorescencji Indo-1 ze stanów bezwapniowych do stanów związanych z wapniem potwierdza napływ wapnia wywołany przez receptor limfocytów T.

Na początek przygotuj 1 mikrogram na mikrolitr roztworu podstawowego Indo-1 AM, dodając 50 mikrolitrów DMSO do fiolki zawierającej 50 mikrogramów Indo-1 AM. Rozcieńczyć roztwór podstawowy do odpowiedniej objętości cRPMI w stężeniu 6 mikrogramów na mililitr.

Umieść pożywkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie użyj tego podłoża do rozcieńczenia wcześniej przygotowanej zawiesiny komórek w stosunku 1 do 1, aby uzyskać od 5 do 6 milionów komórek na mililitr. Następnie, do 12-dołkowej płytki do hodowli tkankowej, dodaj 1 mililitr zawiesiny komórek na dołek, na warunki eksperymentalne.

Przygotować pojedynczo barwioną próbkę kontrolną dla Indo-1 AM wolnego od wapnia, dodając EGTA do komórek obciążonych barwnikiem Indo-1. Napraw studnię w celu biologicznej kontroli negatywnej bez fluoroforów lub barwnika Indo-1. Przygotować kontrolę pozytywną Indo-1, dodając jonomycynę o stężeniu 50 mikromoli do zawiesiny komórek obciążonej barwnikiem na cytometrze przepływowym.

Przygotuj również studzienkę do kontroli pojedynczego barwienia dla dodatkowych populacji komórek, używając fluoroforów sprzężonych z przeciwciałami. Następnie dodać 2 mikrogramy przeciwciała blokującego receptor FC na milion komórek i inkubować płytkę przez 45 minut, stukając co 15 minut w celu ponownego zawieszenia komórek.

Po inkubacji wymieszaj i usuń całą objętość komórek z płytki i dodaj ją do 1,7-mililitrowych probówek wirówkowych. Odwirować i zdekantować supernatant. Po umyciu komórek 1 mililitrem wstępnie podgrzanego cRPMI, ponownie osadzać osad i dekantować supernatant.

Ponownie zawiesić komórki w 1 mililitrze cRPMI i inkubować każdą probówkę, pozostawiając górną część probówki lekko otwartą na wymianę gazową, umożliwiając całkowitą deestryfikację wewnątrzkomórkowych estrów AM. Następnie przygotuj główną mieszankę wszystkich zdefiniowanych przez użytkownika przeciwciał sprzężonych z fluorochromem i dodaj ją do komórek spoczynkowych na 1 mililitr objętości komórki.

Po odpoczynku osadzaj ogniwa i myj je przez ponowne zawieszenie w 1 mililitrze cRPMI schłodzonego do 4 stopni Celsjusza. Powtórz ten krok i umieść rurki na lodzie. Zawiesić poszczególne próbki w 500 mikrolitrach cRPMI bez czerwieni fenolowej, używając 5-mililitrowej rurki przepływowej z polistyrenu z nasadką.

Aby utrzymać temperaturę za pomocą analizy strumienia wapnia, przygotuj kąpiel perełkową, dodając kulki do kąpieli do małej łaźni wodnej i podgrzej ją do 37 stopni Celsjusza. Ostrożnie przetnij 50-mililitrową stożkową rurkę na pół i wyrzuć górną część tuby. Napełnij 3/4 pozostałej rurki koralikami do kąpieli i pozwól jej osiągnąć 37 stopni Celsjusza w kąpieli perełkowej.

Umieść wannę perełkową w pobliżu cytometru przepływowego wraz ze styropianowym stojakiem, aby ustawić rurkę. Przed analizą na cytometrze przepływowym należy ogrzać probówki pojedynczo do 37 stopni Celsjusza przez siedem minut. Zaloguj się do oprogramowania cytometru przepływowego i kliknij kartę Biblioteka.

Następnie wybierz znaczniki fluorescencyjne, aby dodać Indo-1 związany z wapniem i Indo-1 wolny od wapnia. Następnie wybierz Laser UV w grupach znaczników fluorescencyjnych i kliknij Plus Dodaj, aby dodać nazwę znacznika fluorescencyjnego. Wybierz długość fali wzbudzenia i emisji lasera, a następnie kliknij przycisk Zapisz.

Przejdź do konfiguracji eksperymentalnej. kliknij kartę Akwizycja. Otwórz lub utwórz nowy eksperyment i dodaj do niego żądane znaczniki fluorescencyjne. Utwórz grupę odniesienia i nową grupę próbki dla eksperymentu, a następnie oznacz obie grupy.

Na karcie Przejęcia ustaw zdarzenia do zarejestrowania na maksimum na 10 milionów, zatrzymanie woluminu do maksymalnej objętości 3 000 mikrolitrów i czas zatrzymania na maksimum 36 000 sekund. Uzyskaj pojedynczo barwione kontrole dla zdefiniowanych przez użytkownika sprzężonych przeciwciał, zawartych w panelu wielokolorowym, oraz dla barwnika funkcjonalnego Indo-1.

Dodaj 50 mikromoli jonomycyny do związanej z wapniem kontroli pozytywnej Indo-1 i wiru. Dodaj rurkę przepływową do płytki iniekcyjnej próbki i kliknij przycisk Nagraj. Następnie dodaj bezwapniową kontrolę ujemną Indo-1 do cytometru przepływowego i kliknij przycisk Nagraj.

Rozmieszaj pojedynczo poplamione kontrolki, klikając przycisk Rozmieszaj. Po zakończeniu rozmieszania utwórz wykresy sekwencyjne za pomocą arkusza niezmieszanego, takie jak SSCA kontra FSCA do usuwania zanieczyszczeń z próbki i SSCA kontra SSCH do usuwania dubletów.

Następnie utwórz bramy, klikając Działka. Dodaj wykres do arkusza roboczego i kliknij dwukrotnie wewnątrz bramy, aby utworzyć podrzędną populację bramkowaną. Kontynuuj, aż wszystkie populacje będące przedmiotem zainteresowania zostaną uwzględnione. Następnie należy podgrzać wcześniej przygotowane pojedynczo barwione próbki kontrolne do 37 stopni Celsjusza w celu analizy sekwencyjnej.

Zainstaluj oprogramowanie do cytometrii przepływowej i uruchom dejonizowaną wodę przez 2 do 3 minut, aby zapewnić stabilność płynną cytometru przepływowego. Skonfiguruj wykresy sekwencyjne w niemieszanym arkuszu, tworząc bramki za pomocą przycisków bramki wielokąta, prostokąta lub elipsy w celu uwzględnienia interesującej populacji.

Kliknij dwukrotnie wewnątrz bramki i zmień parametry osi y i x na SSCA lub SSCH. Zakończ definiowanie parametrów osi, klikając ją lewym przyciskiem myszy. Utwórz wykres z sygnałem SSCA w stosunku do żywotności barwnika. Bramka żywych komórek, które są barwione barwnikiem ujemnym lub aminowym.

Żywe komórki ujemne dla barwienia żywych żywych żywych ciał będą skupiać się na znaku zerowym zarówno na osi y, jak i x. Kliknij dwukrotnie wykres wewnętrzny, aby utworzyć nowy wykres zawierający tylko żywe limfocyty jednokomórkowe. Zmień oś y na jeden w funkcji czasu na osi x, aby uwidocznić napływ wapnia.

Następnie umieść podgrzaną próbkę biologiczną w SIT maszyny. Uruchom próbki z częstotliwością od 2 500 do 3 000 zdarzeń na sekundę przy średnim natężeniu przepływu, aby uwidocznić napływ wapnia w ograniczonej liczbie populacji komórek. Dodaj następną rurkę do kąpieli perełkowej.

W polu Kontrola akwizycji naciśnij przycisk Nagraj, aby rejestrować dane początkowe przez 30 sekund w celu uzyskania podstawowego poziomu sygnalizacji wapniowej w próbce. Następnie kliknij przycisk Stop i wyjmij probówkę z portu wstrzykiwania próbki. Dodać 30 mikrogramów niesprzężonego anty-CD3 bezpośrednio do probówki z próbką, aby zainicjować napływ wapnia.

Szybko umieść probówkę z powrotem w porcie wstrzykiwania próbki i naciśnij przycisk Nagraj w oprogramowaniu. Rejestruj dane przez siedem minut, obserwując czas, który upłynął pod kontrolą akwizycji w oprogramowaniu. Następnie naciśnij Stop w oprogramowaniu.