Test do ilościowego określenia wiązania ludzkich norowirusów VLP z bakteriami jelitowymi

Weź probówkę zawierającą zawiesinę ludzkich bakterii jelitowych.

Dodaj cząsteczki podobne do ludzkiego wirusa norowirusowego lub VLP. VLP zawierają nienaruszony kapsyd wirusa, ale nie mają genomowego RNA, co czyni je niezakaźnymi dla ludzi.

Podczas inkubacji białka kapsydu VLP wiążą się ze specyficznymi węglowodanami ulegającymi ekspresji na powierzchni bakterii, tworząc kompleksy VLP-bakterie.

Odwirować w celu osadzenia kompleksów i odrzucenia niezwiązanych VLP.

Wprowadzić roztwór blokujący zawierający białko, aby zablokować niespecyficzne miejsca wiązania przeciwciał, zmniejszając barwienie tła w kolejnych krokach.

Dodaj znakowane fluorescencyjnie przeciwciała specyficzne dla VLP i inkubuj.

Przeciwciała wiążą się ze swoimi miejscami docelowymi na kapsydzie VLP, znakując kompleksy bakterii VLP.

Wirówka do granulowania kompleksów. Odrzucić niezwiązane przeciwciała i ponownie zawiesić osad w buforze cytometrii przepływowej.

Za pomocą cytometru przepływowego wykryj sygnały fluorescencyjne emitowane przez kompleksy bakterii VLP, co pozwoli na ilościowe określenie procentowej zawartości bakterii związanych w próbce.

Po przygotowaniu odczynników, przeciwciał i bakterii zgodnie z opisem w manuskrypcie, zbierz wszystkie materiały w komorze bezpieczeństwa biologicznego BSL II.

Cząsteczki wirusopodobne do ludzkiego norowirusa są wymienione jako patogeny BSL II, a wszystkie prace wykonywane przy użyciu VLP powinny być wykonywane w certyfikowanej komorze bezpieczeństwa biologicznego.

Dodać 10 mikrogramów ludzkich norowirusów VLP do każdej probówki z bakteriami i dokładnie wymieszać przez pipetowanie. Inkubować probówki przez 1 godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza ze stałą rotacją. Po inkubacji odwirować probówki pod ciśnieniem 10 000 razy g przez 5 minut.

Odessać i wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad bakteryjny w 1 mililitrze PBS. Po jednokrotnym powtórzeniu etapów mycia, ponownie odwirować probówki z prędkością 10 000 g przez 5 minut. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad bakterii VLP w 150 mikrolitrach 5% buforu blokującego.

Częstym błędem, który występuje, jest zamiana rurek i dodanie niewłaściwej obróbki. Aby temu zapobiec, ułóż wszystkie probówki w liniach odpowiadających prawidłowemu zabiegowi i dodaj po jednym zabiegu na raz do probówek.

Dla każdej próbki bakteryjnej przygotuj 50 mikrolitrów rozcieńczonego ludzkiego przeciwciała przeciwko norowirusowi G2. Używając 5% buforu blokującego, rozcieńczyć przeciwciało od 1 do 125 dla próbek przypadków E. coli. Przygotować 50 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała izotypowego dla każdej próbki bakteryjnej przy użyciu tych samych proporcji rozcieńczenia. Podziel każdą próbkę testową z załącznikiem na podwielokrotności o pojemności 350 mikrolitrów, przenosząc je do czystych 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych.

Aby utworzyć niebarwione kontrole, dodaj 50 mikrolitrów buforu blokującego do pierwszej porcji z każdej próbki bakteryjnej. W przypadku barwionych próbek dodać 50 mikrolitrów rozcieńczenia przeciwciała G2 do drugiego zestawu podwielokrotności. Utwórz kontrole izotypu, dodając 50 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała izotypu do trzeciego zestawu podwielokrotności.

Inkubować wszystkie próbki na lodzie i w ciemności przez 30 minut. Następnie odwirować wszystkie próbki w temperaturze 10 000 razy g przez 5 minut. Odrzucić supernatanty i ponownie zawiesić każdą próbkę w 150 mikrolitrach FCSB. Ponownie odwirować wszystkie próbki pod ciśnieniem 10 000 g przez 5 minut. Ponownie wyrzucić supernatanty i ponownie zawiesić próbki w 100 mikrolitrach FCSB.

Po ostatnim odwirowaniu próbek i odrzuceniu supernatantu, ponownie zawiesić próbki w 150 mikrolitrach FCSB. Przenieść każdą próbkę do probówki zawierającej 400 mikrolitrów FCSB, co daje całkowitą objętość 550 mikrolitrów. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza do czasu ich analizy za pomocą cytometrii przepływowej.