Multipleksowane obrazowanie immunofluorescencyjne w celu analizy subpopulacji limfocytów T opornych na immunoterapię

Weźmy kriosekcję tkankową raka nerkowokomórkowego wykazującą naciekające limfocyty T CD8 + w mikrośrodowisku guza.

Potraktuj go acetonem, aby naprawić i przepuszczalność tkanki. Umyć, aby usunąć nadmiar acetonu.

Dodaj awidynę, aby nasycić endogenną biotynę tkankową. Następnie dodaj biotynę, aby zablokować unieruchomione miejsca wiązania awidyny, minimalizując niespecyficzne interakcje.

Zastosuj surowicę zawierającą immunoglobuliny, aby zablokować receptory Fc komórek odpornościowych, zapobiegając niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał.

Dodać pierwszorzędowy koktajl przeciwciał ukierunkowany na CD8, cytotoksyczny marker limfocytów T, oraz PD-1 i Tim-3, receptory hamujące ulegające ekspresji przez subpopulacje limfocytów T CD8 + oporne na immunoterapię.

Wprowadź odrębne przeciwciała drugorzędowe znakowane fluoroforem skierowane przeciwko przeciwciałom anty-CD8 i anty-Tim-3.

Dodać biotynylowane przeciwciała drugorzędowe skierowane przeciwko przeciwciałom anty-PD-1 i inne znakowane fluoroforem streptawidynę wiążące się z biotyną.

Nałożyć podłoże mocujące zawierające barwnik na wybarwienie jąder komórkowych i umieścić szkiełko nakrywkowe.

Uzyskaj wielospektralne obrazy fluorescencyjne, aby zidentyfikować limfocyty T CD8 + naciekające nowotwór i subpopulacje oporne na immunoterapię wykazujące ekspresję PD-1, Tim-3 lub obu.

Po rozmrożeniu za pomocą ręcznika papierowego ostrożnie osusz szkiełka wokół odcinków tkanek i owiń tkanki hydrofobowym pisakiem barierowym. Po wyschnięciu bariery utrwalić próbki w 100% acetonie na 5 minut, a następnie wysuszyć na powietrzu przez 2 minuty. Następnie myj szkiełka w TBS przez 10 minut.

Preparaty należy potraktować trzema kroplami 0,1% awidyny przez 10 minut w ciemności. Następnie dotknij lub przesuń szkiełka, aby pokryć tkankę roztworem awidyny. Dodaj trzy krople 0,01% biotyny do każdej próbki i postukaj lub przesuń biotynę po próbkach, a następnie przemyj TBS, jak pokazano. Następnie zablokuj wszelkie niespecyficzne wiązania za pomocą 100 mikrolitrów 5% normalnej surowicy w TBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Pod koniec inkubacji postukaj w szkiełka, aby usunąć nadmiar surowicy, a następnie inkubuj szkiełka w 100 mikrolitrach podstawowego koktajlu przeciwciał przez 1 godzinę w wilgotnej komorze. Myć szkiełka znakowane przeciwciałami w TBST przez 5 minut.

Po wysuszeniu oznacz komórki 100 mikrolitrami interesującego nas koktajlu przeciwciał wtórnych przez 30 minut w wilgotnej komorze, a następnie przemyj je przez 10 minut w TBS. Inkubuj wysuszone szkiełka znakowane przeciwciałami wtórnymi ze 100 mikrolitrami interesującego nas koktajlu przeciwciał trzeciorzędowych przez 30 minut, a następnie ostatnie 10-minutowe płukanie TBS.

Pod koniec prania wysusz szkiełka i zamontuj chusteczki za pomocą środka montażowego uzupełnionego przez DAPI. Następnie przykryj każde szkiełko szkiełkiem nakrywkowym i pozwól medium montażowemu zastygnąć przez co najmniej 2 godziny.

Aby zeskanować szkiełka, otwórz oprogramowanie mikroskopu i załaduj protokół skanowania obrazu. Załaduj pierwsze szkiełko na stolik mikroskopu. Następnie na pasku narzędzi kliknij opcję Ustaw ekspozycję i dostosuj czas ekspozycji dla każdego filtra, aż do uzyskania wystarczającego, ale nienasyconego sygnału.

Kliknij przycisk Start w górnym panelu i otwórz folder z identyfikatorem laboratorium. Wprowadź identyfikator pierwszego slajdu i kliknij przycisk Dalej.

Aby uzyskać przegląd slajdu w jasnym świetle pola przy 4-krotnym powiększeniu, kliknij opcję Monochrome Imaging (Obrazowanie monochromatyczne) i Find Specimen (Znajdź próbkę). Aby wybrać obszar tkanki do skanowania, naciśnij Control i użyj kursora, aby zaznaczyć lub odznaczyć obszary zainteresowania, które mają być skanowane przy 4-krotnym powiększeniu.

Aby uzyskać fluorescencyjny czerwono-niebiesko-zielony obraz każdego regionu, kliknij opcję Obrazowanie o niskim poborze mocy. Aby wybrać pole o dużej mocy, naciśnij Control i wybierz co najmniej pięć obszarów zainteresowania, które odpowiadają obszarom tkanki, które będą skanowane przy 20-krotnym powiększeniu.

Następnie, aby uzyskać wielospektralną akwizycję obrazu dla każdego pola, kliknij opcję High-Power Imaging (Obrazowanie o dużej mocy), a następnie kliknij opcję Data Storage (Magazyn danych), aby zapisać obrazy w odpowiednim folderze o identyfikatorze laboratorium.