Technika immunofluorescencji lokalizacji białek wirusowych w zakażonych komórkach

Zacznij od szkiełka zawierającego przylegające komórki gospodarza.

Dodaj wirusy i pozwól im dostać się do komórek gospodarza.

Usuń zużyte medium. Dodaj świeżą pożywkę, aby umożliwić syntezę i transport białek wirusa.

Użyj paraformaldehydu, aby zachować morfologię komórek i lokalizację białka.

Dodaj cząsteczki detergentu, aby komórki były przepuszczalne.

Zastosuj bufor blokujący, aby zablokować miejsca powiązań inne niż docelowe.

Dodaj przeciwciała pierwszorzędowe, które wiążą docelowe białka wirusowe. Usuń niezwiązane przeciwciała.

Nakładka z czerwonymi przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem do fluorescencyjnego znakowania białek wirusa. Usuń niezwiązane przeciwciała.

Dodaj fluorescencyjny barwnik jądrowy zawierający pożywkę montażową, aby zabarwić jądra.

Za pomocą mikroskopii konfokalnej obserwuj położenie białek wirusowych o czerwonej fluorescencji i jąder gospodarza o niebieskiej fluorescencji.

Silniejszy czerwony sygnał wokół niebieskiego obszaru wskazuje na lokalizację cytoplazmatyczną, podczas gdy silniejszy sygnał wewnątrz sugeruje lokalizację jądrową.

Równe poziomy sygnału w niebieskim obszarze i wokół niego wskazują, że białka znajdują się zarówno w jądrze, jak i cytoplazmie.

20 do 24 godzin przed infekcją wirusową wysiej 5 x 10⁴ ludzkie embrionalne komórki płuc lub fibroblasty HEL na studzienkę na 4-dołkowym 11-milimetrowym szkiełku naprzemiennym w pożywce wzrostowej do nocnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza, z 5% dwutlenkiem węgla.

Ważne jest, aby dokładnie kołysać szkiełkiem, aby zapewnić równomierne rozłożenie komórek, jednocześnie uważając, aby nie rozlać pożywki hodowlanej. Następnego dnia zastąp supernatanty z 70% do 80% zlewających się kultur Medium-199 zawierającym 4-10 jednostek tworzących blaszkę na komórkę i umieść szkiełko w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przez 1 godzinę.

Pod koniec inkubacji zastąpić supernatanty świeżą pożywką wzrostową i umieścić komórki z powrotem w inkubatorze na odpowiedni okres eksperymentalnego zakażenia. W celu barwienia immunofluorescencyjnego komórek zakażonych wirusem, szybko przemyj komórki trzykrotnie PBS, a następnie wykonaj 8 do 10-minutową inkubację w 200 mikrolitrach 4% paraformaldehydu w PBS na studzienkę. Pod koniec utrwalania przemyj komórki trzykrotnie 200 mikrolitrami PBS na pranie i przesiąknij komórki 100 mikrolitrami 0,2% niejonowego środka powierzchniowo czynnego na studzienkę przez 5 do 10 minut.

Przemyć permeabilizowane komórki trzykrotnie w PBS, jak pokazano, i dodać 200 mikrolitrów buforu blokującego do każdej studzienki na 1-godzinną inkubację w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj odpowiednie stężenie podstawowego przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania do każdej studzienki w celu 2-godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej.

Pod koniec inkubacji usunąć wszelkie niezwiązane przeciwciała pierwszorzędowe za pomocą trzech 10-minutowych płukań w świeżym buforze blokującym i dodać odpowiednie przeciwciało drugorzędowe do każdej studzienki na 1-godzinną inkubację w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.

Pod koniec inkubacji przemyć komórki trzy razy w buforze blokującym, jak pokazano, a następnie raz przemyć w PBS i dodać jedną kroplę pożywki montażowej zapobiegającej blaknięciu, uzupełnionej DAPI do każdej studzienki. Następnie umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym i uszczelnij szkiełko nakrywkowe przezroczystym lakierem do paznokci.

Delikatny nacisk podczas montażu szkiełka nakrywkowego usunie nadmiar nośnika mocującego, pomagając zapewnić uzyskanie wysokiej jakości obrazów.

Aby przeanalizować rozkład jądrowy i cytoplazmatyczny ICP0, otwórz projekt w oprogramowaniu konfokalnym i wybierz obraz. Otwórz kartę Ilość i wybierz opcję Sortuj obszary zainteresowania z menu Narzędzia. Wybierz opcję Rysuj linię i narysuj linię podłużną w poprzek komórki, która ma być analizowana. Pojawi się histogram pokazujący intensywność fluorescencji wzdłuż linii zarówno dla białka będącego przedmiotem zainteresowania, jak i DAPI.

Na podstawie barwienia tła ustal stały próg intensywności białka będącego przedmiotem zainteresowania dla analizy subkomórkowej dystrybucji białka w każdym eksperymencie. Jeśli sygnał białkowy jest średnio poniżej progu w regionie jądrowym, ale jest powyżej progu poza granicą DAPI, sklasyfikuj sygnał białkowy jako zlokalizowany głównie w cytoplazmie.

Jeśli sygnał białkowy znajduje się powyżej progu w całym jądrze i poza granicą sygnału DAPI, pogrupuj sygnał białkowy jako jądro plus lokalizacja cytoplazmatyczna. Jeśli sygnał białkowy znajduje się powyżej progu w jądrze, ale średnio jest poniżej progu poza granicą sygnału DAPI, pogrupuj sygnał białkowy jako lokalizację jądrową.