JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 3:45 min. • December 22nd, 2025
Zacznij od wielodołkowej płytki zawierającej przylegające mysie makrofagi - lub fagocytarne komórki odpornościowe.
Wprowadź zawiesinę komórek grzyba Cryptococcus, wchodzącą w interakcję z receptorami makrofagów i internalizującą poprzez fagocytozę.
Fagosom łączy się z lizosomem, tworząc fagolizosom. Kwaśne środowisko fagolizosomu sprzyja przetrwaniu i namnażaniu się grzybów.
Wprowadzić do studzienek testowych wysokie stężenie prymachiny – fotouczulacza, podczas gdy w kontroli brakuje fotouczulacza. Inkubować w celu ułatwienia wychwytu prymachiny przez makrofagi.
Wystaw płytkę na działanie światła ultrafioletowego w celu leczenia fotodynamicznego lub PDT.
W studzience testowej prymachina tworzy rodnikowe kationy, które oddziałują z tlenem cząsteczkowym, wytwarzając reaktywne formy tlenu lub ROS.
ROS indukują śmierć grzybów, podczas gdy enzymy antyoksydacyjne makrofagów neutralizują ROS, zapobiegając uszkodzeniom komórek.
Przepuszczalność makrofagów, uwalnianie komórek grzybów.
Rozcieńczoną zawartość komórek rozprowadzić na selektywnych płytkach agarowych, uzyskując wyraźne kolonie grzybów.
Mniejsza liczba kolonii na płytce testowej w porównaniu z grupą kontrolną wskazuje na zwiększoną wydajność fagocytarną makrofagów dzięki fotodynamicznemu traktowaniu prymachiną.
Rozpocznij od zawieszenia mysiej linii komórkowej makrofagów w kompletnej pożywce RPMI 1640, jak wspomniano w protokole tekstowym. Dozować 100 mikrolitrów tej zawiesiny komórkowej do studzienek sterylnej 96-dołkowej płytki hodowlanej z płaskim dnem. Inkubować płytkę przez noc w inkubatorze.
Następnego dnia wyjmij płytkę z inkubatora. Zastąp zużytą pożywkę 100 mikrolitrami świeżej pożywki RPMI-1640. Następnie dozuj 100 mikrolitrów zawiesiny komórek kryptokokowych do płytki hodowlanej zawierającej zasiane makrofagi.
Aby zbadać efekt fotodynamiczny, przygotuj pożądane stężenia robocze fotouczulacza. Dodaj 100 mikrolitrów roztworu roboczego do płytki wstępnie wysianej makrofagami i komórkami kryptokokowymi.
Inkubować płytkę w ciemności, aby komórki zareagowały z lekiem. Po inkubacji wystawić płytki na działanie światła UV przez dwie minuty.
Po rozpoczęciu leczenia fotodynamicznego inkubować płytki hodowlane przez 18 godzin. Po inkubacji usunąć supernatant i przemyć komórki 200 mikrolitrami roztworu buforu fosforanowego.
Dodaj 300 mikrolitrów 0,1% Triton X-100 do studzienek i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
Odessać zawartość każdej studzienki i dozować ją do pojedynczych sterylnych 1,5-mililitrowych plastikowych probówek. Rozcieńczyć komórki 10 razy wodą destylowaną i odpipetować 50 mikrolitrów rozcieńczenia na indywidualne płytki agarowe z ekstraktem słodu drożdżowego.
Użyj metody płytki do rozprowadzania, aby stworzyć zlewający się trawnik komórek na powierzchni płytki agarowej. Inkubować płytki przez 48 godzin. Policz jednostki tworzące kolonie na płytkach agarowych.