Wpływ aspiryny i ibuprofenu na zdolność fagocytarną makrofagów

Zacznij od zawiesiny grzybów Cryptococcus. Dodaj roztwór biocząstek pochodzących z grzybów sprzężonych z barwnikiem fluorescencyjnym wrażliwym na pH, aby zabarwić komórki Cryptococcus.

Umyj, aby usunąć niezwiązany barwnik. Przenieś zabarwioną zawiesinę grzybów na wielodołkową płytkę z przylegającymi makrofagami - lub fagocytarnymi komórkami odpornościowymi.

Wprowadzić minimalne stężenie hamujące leku, takiego jak aspiryna lub ibuprofen, i inkubować, aby ułatwić wchłanianie leku.

Cząsteczki leku oddziałują z cyklooksygenazą-2 – enzymem syntetyzującym prostaglandyny, hamując jego aktywność.

Zapobiega to przemianie kwasu arachidonowego w prostaglandynę, zachowując wewnątrzkomórkowe poziomy cAMP i zwiększając zdolność fagocytarną makrofagów, ułatwiając internalizację grzybów.

Fagosom zawierający grzyby łączy się z lizosomem - kwaśną organellą, tworząc fagolizosom o kwaśnym pH i umożliwiając fluoryzację barwnika.

Komórki leczone lekiem wykazują wyższą fluorescencję niż komórki nieleczone, co sugeruje skuteczność leku w zwiększaniu zdolności fagocytarnych makrofagów.

Rozpocznij od hodowli mysiej linii komórkowej makrofagów, wyhodowanej w kompletnej pożywce RPMI 1640, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Dodatkowo należy przygotować kulturę Cryptococcus neoformans zawieszoną w PBS do pożądanego stężenia, jak wspomniano w protokole tekstowym.

Aby zabarwić komórki kryptokokowe barwnikiem fagocytozy, należy dozować 999 mikrolitrów komórek do probówki mikrowirówkowej. Dodaj 1 mikrolitr plamy do tuby. Inkubować komórki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, w ciemności, z powolnym mieszaniem.

Po inkubacji umyj komórki przez pierwsze odwirowanie. Następnie odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki za pomocą PBS i powtórzyć etap mycia jeszcze dwa razy.

Dozować 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej Cryptococcus neoformans do studzienek 96-dołkowej płytki zawierającej hodowane makrofagi.

Aby zbadać wpływ badanych leków na fagocytozę makrofagów, należy dozować 100 mikrolitrów pożądanego badanego leku do odpowiednich dołków płytki 96-dołkowej, jak opisano w protokole tekstowym.

Inkubować płytkę w inkubatorze dwutlenku węgla przez 2 do 6 godzin. Pod koniec inkubacji zmierz fluorescencję z barwienia fagocytarnego.