Metoda immunofluorescencyjna do pomiaru neutralizacji ludzkiego wirusa cytomegalii

Weź seryjne rozcieńczenia przeciwciał specyficznych dla ludzkiego wirusa cytomegalii lub HCMV.

Po dodaniu HCMV przeciwciała wiążą się z glikoproteiną B na otoczce wirusa, neutralizując wirusa.

Przenieś mieszaninę na ludzkie fibroblasty i inkubuj.

Kompleks glikoproteiny trimerowej na niezneutralizowanych wirusach wiąże się ze specyficznymi receptorami komórkowymi, wywołując fuzję błony wirusa-gospodarza za pośrednictwem glikoproteiny B i uwalniając wewnątrz nukleokapsyd zawierający genomowe DNA.

Uwolniony genom dostaje się do jądra, kodując białka zlokalizowane natychmiast wcześnie (IE) zlokalizowane w jądrze jądrowym.

Neutralizacja przeciwciał zapobiega przedostawaniu się wirusa do komórek.

Usuń niezinternalizowane wirusy. Potraktuj etanolem w temperaturze poniżej zera, aby utrwalić i przepuszczalność komórek.

Wprowadź przeciwciało pierwszorzędowe, które wiąże się z białkami IE.

Dodaj przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluoroforem, które wiąże się z przeciwciałem pierwszorzędowym i barwienie fluorescencyjne, które wiąże się z DNA.

Pod mikroskopem wykryj podwójnie barwione komórki, które są zainfekowane wirusem. Oblicz procent zakażonych komórek, aby określić neutralizację wirusa przy różnych stężeniach przeciwciał.

W dniu poprzedzającym eksperyment należy przygotować komórki docelowe do infekcji poprzez hodowlę komórek fibroblastów, hodowanych w kompletnych pożywkach, składających się z DMEM uzupełnionego 10% FBS, na sterylnej 96-dołkowej płytce.

Po 24 godzinach przygotuj mieszaninę wirus-przeciwciało, dodając 90 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu przeciwciał do studzienek świeżej 96-dołkowej płytki. Przygotować seryjne rozcieńczenia roztworu przeciwciała przy użyciu kompletnych pożywek.

Dodatkowo dodać 60 mikrolitrów roztworu wirusa, wstępnie rozcieńczonego w kompletnej pożywce, do każdej studzienki zawierającej przeciwciała, aby wytworzyć różne stężenia mieszanin wirus-przeciwciało i inkubować.

Teraz, aby zainfekować komórki docelowe, weź płytkę wypełnioną fibroblastami. Dodać do komórek 100 mikrolitrów mieszaniny wirus-przeciwciało o różnych stężeniach i inkubować płytkę docelową przez 24 godziny.

Po 24 godzinach, aby wykryć infekcję wirusową za pomocą immunofluorescencji, utrwal komórki absolutnym etanolem i inkubuj je w zamrażarce o temperaturze -20 stopni Celsjusza. Po utrwaleniu przejdź do kolejnych kroków na stole laboratoryjnym.

Pobrać pipetą 100 μl przeciwciała pierwszorzędowego do wszystkich dołków płytki. Umieść talerz w temperaturze pokojowej na godzinę.

Usunąć pierwszorzędowy roztwór przeciwciała z dołków. Dodaj mieszaninę przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z fluoroforem i roztworu DAPI do wszystkich studzienek. Inkubuj płytkę przez godzinę w ciemności i umyj płytkę.

Aby określić ilościowo infekcję, zwizualizuj płytkę pod mikroskopem i uzyskaj obrazy za pomocą kanałów niebieskiego i czerwonego. Oblicz procent infekcji na studzienkę, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.