Procedura końcówki STAGE do odsalania i oczyszczania peptydów

Weź STop And Go Extraction lub STAGE Tip, zminiaturyzowaną kolumnę oczyszczającą.

Końcówka zawiera małe kulki krzemionki połączone z długimi łańcuchami węglowodorowymi w celu oczyszczania peptydów opartych na oddziaływaniach hydrofobowych.

Przemyć zawierającymi wysoki procent acetonitrylu, usuwając zanieczyszczenia żywiczne.

Wprowadzić bufor wiążący i odwirówkę, równoważąc kolumnę w celu optymalnego wiązania peptydów.

Załadować wstępnie strawioną próbkę peptydu uzyskaną ze zróżnicowanych komórek podobnych do neutrofili, zawierającą fragmenty peptydów i zanieczyszczenia, w tym sole.

Odwirować w celu przepuszczenia próbki przez kolumnę. Fragmenty peptydów wiążą się z łańcuchami węglowodorowymi poprzez oddziaływania hydrofobowe, podczas gdy sole są usuwane.

Dodać bufor wiążący i odwirówkę, usuwając pozostałe zanieczyszczenia.

Wprowadzić bufor o wysokiej zawartości acetonitrylu do elucji.

Za pomocą strzykawki przepuścić bufor przez kolumnę. Acetonitryl wiąże się z łańcuchami węglowodorowymi, wypierając fragmenty peptydu, które eluują wraz z buforem.

Wykonaj profilowanie proteomiczne, aby zidentyfikować oczyszczone peptydy.

Na początek zapakuj trzy warstwy żywicy C18 w końcówkę pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby skonstruować końcówkę do ekstrakcji STop And Go lub STAGE dla każdej próbki peptydu.

Zatrzymać trawienie enzymatyczne poprzednio inkubowanych próbek peptydów, dodając 1 na 10 objętości roztworu zatrzymującego. Odwirować próbki z prędkością 13 200 obr./min przez 10 minut i przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 2 mililitrów.

Następnie umyj końcówki STAGE 100 mikrolitrami 100-procentowego acetonitrylu i odwiruj końcówki STAGE przy 1000 g przez 2 minuty lub do momentu, gdy cały płyn przejdzie przez żywicę C18.

Powtórz płukanie końcówki STAGE 50 mikrolitrami buforu B, a następnie 200 mikrolitrami buforu A w tych samych warunkach wirowania.

Załaduj próbki do końcówek STAGE, aby odwirować przy 1000 g przez 3 do 5 minut. Następnie przemyj końcówki STAGE 200 mikrolitrami buforu A przez odwirowanie przy 1000 g przez 3 do 5 minut.

Następnie dodaj 50 mikrolitrów buforu B do każdej końcówki STAGE i za pomocą strzykawki wymyj próbki zawierające bufor B do 0,2-mililitrowej probówki do PCR.

Po wymyciu próbek suszyć peptydy za pomocą wirówki próżniowej przez 45 minut. Próbki należy poddać spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości w warunkach opisanych w manuskrypcie.

Aby przetworzyć dane do profilowania proteomicznego, należy przesłać pliki danych surowych uzyskane ze spektrometrii mas do oprogramowania MaxQuant. Zapoznaj się z rękopisem tekstowym, aby zapoznać się ze wszystkimi parametrami oprogramowania i jego dostosowaniami.

W parametrach globalnych zaimportuj plik FASTA Homo sapiens w celu identyfikacji sekwencji pobrany z bazy danych Uniprot rejestrujący identyfikator organizmu, liczbę białek i datę pobrania pliku.

Ustaw liczbę rdzeni komputera do przetwarzania i wybierz pozycję Uruchom. Po zakończeniu MaxQuant generowany jest folder "Combined" wraz z innymi plikami potrzebnymi do przesłania do repozytoriów danych.

Aby przeanalizować dane, prześlij "proteingroups.txt" do Perseusa i wybierz wszystkie pliki z kwantyfikacją bez etykiet lub intensywnością LFQ do okna "Głównego". Przefiltruj wiersze, usuwając zanieczyszczenia, peptydy odwrotne i peptydy zidentyfikowane tylko przez lokalizację, a następnie przekształć dane według logarytmu₂(x).

Aby zaobserwować liczbę białek wykrytych w każdej kontrpróbie, należy skonstruować numeryczny diagram Venna i ustawić adnotacje kategoryczne dla każdej próbki, podając tę samą nazwę dla wszystkich powtórzeń jednej próbki biologicznej.

Przefiltruj wiersze na podstawie prawidłowej wartości z białkiem zidentyfikowanym w ponad 50 procentach powtórzeń i w co najmniej jednej grupie. Aby zastąpić brakujące wartości LFQ, należy wykonać imputację z rozkładu normalnego.

Dodaj informacje o adnotacjach pobrane ze strony internetowej Perseusa do wierszy białek, dodając txt.gz plików FASTA w folderach "bin", "conf" i "adnotation". Wprowadź konkretne terminy, takie jak nazwy białek, nazwy genów i ontologia genów.

Macierz jest teraz kompletna i można ją wizualizować w narzędziach, takich jak wykresy analizy głównych komponentów, mapy cieplne i wzbogacanie kategorii. Wykonaj testy statystyczne w celu określenia istotnych zmian w obfitości białka między badanymi warunkami.