Ocena funkcjonalnych przeciwciał neutralizujących SARS-CoV-2

Zacznij od seryjnie rozcieńczonej ludzkiej surowicy zawierającej różne stężenia przeciwciał neutralizujących przeciwko koronawirusowi zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 lub SARS-CoV-2.

Wprowadź pseudotypowane wirusy z lucyferazy RNA, integrazą i odwrotną transkryptazą, zamknięte w dwuwarstwie lipidowej zawierającej białka kolców SARS-CoV-2.

Przeciwciała neutralizują wirusy na podstawie rozcieńczenia surowicy, przy czym niższe rozcieńczenia wykazują maksymalną neutralizację.

Wprowadzić komórki docelowe eksprymujące receptory konwertazy angiotensyny-2 lub receptory ACE2 i transbłonową proteazę serynę-2 lub TMPRSS2.

W wyższych rozcieńczeniach surowicy niezneutralizowane wirusy oddziałują z receptorami ACE2, podczas gdy TMPRSS2 rozszczepiają białko kolca, umożliwiając fuzję wirusa.

Po wejściu RNA lucyferazy jest odwrotnie transkrybowane do DNA, które integruje się z genomem gospodarza i wytwarza enzym lucyferazy.

Zastąp pożywkę buforem testowym zawierającym substrat lucyferazy i czynnik lizujący.

Komórki ulegają lizie, uwalniając wewnątrzkomórkową lucyferazę, która oddziałuje z substratem i wytwarza wysoką luminescencję.

Określ ilościowo luminescencję w rozcieńczeniach surowicy, aby określić procent neutralizacji wirusa - rozcieńczenie osiągające pięćdziesięcioprocentową neutralizację reprezentuje miano neutralizacji.

Na początek dodaj 50 mikrolitrów DMEM z 10 procentami FBS i 1 procentem penicyliny-streptomycyny do rzędów od B do H, kolumn od 1 do 12 białej 96-dołkowej płytki.

Dodać 5 mikrolitrów surowic rekonwalescencyjnych do studzienek rzędu A, kolumny od 2 do 10, w całkowitej objętości 100 mikrolitrów DMEM z 10 procentami FBS i 1 procentami penicyliny-streptomycyny. Dodać 5 mikrolitrów dodatnich i ujemnych surowic odpornościowych do studzienek A11 i A12 jako kontrolnych.

Usunąć 50 mikrolitrów roztworu ze studzienek rzędu A i wykonać dwukrotne seryjne rozcieńczenia wszystkich studzienek znajdujących się pod nim. Do każdego rozcieńczenia należy użyć pipety wielokanałowej, aby wymieszać roztwory 5-10 razy, pipetując w górę i w dół bez tworzenia pęcherzyków powietrza.

Po zakończeniu seryjnego rozcieńczania wyrzucić ostatnie 50 mikrolitrów z ostatniego dołka każdej kolumny.

Odwiruj płytkę przez 1 minutę z prędkością 500 obrotów na minutę, aby upewnić się, że na ściankach studzienki nie pozostał żaden płyn. Oblicz ilość DMEM potrzebną do rozcieńczenia PV SARS-CoV-2 zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym.

Wymieszać rozcieńczony roztwór fotowoltaiczny w misce na pipety i wlać do każdej studzienki porcję 50 mikrolitrów, z wyjątkiem studzienek od A6 do A12, które obejmują kontrolę tylko z komórkami. Studnie od A1 do A6 służą wyłącznie do sterowania fotowoltaicznego.

Wirować płytkę przez 1 minutę z prędkością 500 obrotów na minutę, aby upewnić się, że żaden wirus nie pozostał na ściankach studni. Następnie inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5-procentowym dwutlenkiem węgla przez 1 godzinę, aby surowica mogła związać się z glikoproteiną SARS-CoV-2.

Następnie należy przygotować płytkę z komórkami docelowymi HEK 293T/17 transfekowanymi 24 godziny wcześniej plazmidami ACE2 i TMPRSS2. Wyjmij pożywkę hodowlaną z płytki i umyj ją dwukrotnie 2 mililitrami PBS, dodając ją po jednej stronie naczynia, aby uniknąć oderwania komórek.

Wyrzuć PBS i dodaj 2 mililitry trypsyny do talerza. Umieścić płytkę w inkubatorze, aż komórki zostaną odłączone.

Po odłączeniu komórek dodaj 6 mililitrów DMEM z 10 procentami FBS i 1 procentami penicyliny-streptomycyny do płytki, aby ugasić aktywność trypsyny i delikatnie ponownie zawiesić komórki.

Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek lub zliczając szkiełko komory. Dodać 1 x 10⁴ komórki o łącznej objętości 50 mikrolitrów do każdej studzienki i inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5 procentami dwutlenku węgla przez 48 do 72 godzin.

Po inkubacji usunąć pożywki hodowlane ze wszystkich studzienek i dodać 25 mikrolitrów mieszaniny PBS w stosunku 1:1 i komercyjnego odczynnika do oznaczania lucyferazy. Odczytaj płytkę za pomocą komercyjnego systemu testowego lucyferazy z luminometrem mikropłytki.

Korzystając z surowych danych wygenerowanych przez luminometr, oblicz miano przeciwciał neutralizujących IC50 zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym.