Pomiar poziomu immunoglobuliny G w stosunku do testowanej szczepionki w surowicy myszy

Rozpocząć od płytki wielodołkowej pokrytej szczepionką testową i zablokować niespecyficzne miejsca interakcji.

Pobrać próbkę surowicy od myszy, której wstrzyknięto szczepionkę testową.

Surowica ta zawiera immunoglobulinę G lub IgG, przeciwciała, które rozpoznają badaną szczepionkę.

Do studzienek pokrytych szczepionką dodać seryjnie rozcieńczone próbki surowicy.

IgG wiążą się ze szczepionką. Umyć w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał.

Dodaj przeciwciała drugorzędowe sprzężone z peroksydazą, które wiążą się z IgG. Usuń niezwiązane przeciwciała drugorzędowe.

Dodaj podłoże chromogenne. Peroksydaza oddziałuje z substratem, wytwarzając produkt o niebieskim kolorze.

Wprowadź kwas, aby zatrzymać reakcję. Zmiana pH powoduje żółknięcie roztworu.

Za pomocą spektrofotometru zmierz intensywność koloru każdej studzienki, aby określić stężenie IgG w próbce surowicy.

W przypadku powlekania antygenem w teście immunoenzymatycznym lub płytce ELISA, rozcieńczyć antygen białkowy HI do 10 mikrogramów na mililitr roztworem powlekającym i dodać 100 mikrolitrów rozcieńczonego antygenu na basenik do płytki ELISA. Inkubuj płytkę w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez noc. Po inkubacji umyć płytkę 300 mikrolitrami PBST na studzienkę.

Uszczelnij studzienki 300 mikrolitrami roztworu uszczelniającego na studzienkę przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie rozcieńczyć trzy mikrolitry surowicy myszy z każdej grupy eksperymentalnej 100 razy, dodając 297 mikrolitrów PBST i wirować rozcieńczoną surowicę. Dodać 100 mikrolitrów rozcieńczonej surowicy na studzienkę w powlekanej płytce ELISA dla każdej próbki surowicy. Podobnie, rozcieńczyć dodatnią i ujemną surowicę kontrolną 100 razy PBST, dodając 4 mikrolitry pozytywnej lub ujemnej surowicy kontrolnej do 396 mikrolitrów PBST, a następnie mieszając wirowo.

Aby przeprowadzić rozcieńczenie o podwójnym stosunku, dodaj 200 mikrolitrów wcześniej rozcieńczonej surowicy doświadczalnej do pierwszego rzędu powlekanej płytki ELISA. Następnie dodaj 100 mikrolitrów PBST do wszystkich studzienek, z wyjątkiem tych w rzędzie pierwszym i 12. Następnie wyreguluj pistolet do pipet na 100 mikrolitrów i przenieś 100 mikrolitrów surowicy z pierwszego rzędu do drugiego rzędu zawierającego PBST.

Wymieszaj zawartość w drugim rzędzie 10 razy za pomocą pistoletu do pipet. Podobnie wykonuj kolejne rozcieńczenia surowicy w stosunku 1:2 do rzędu 11. Po zakończeniu wylej 100 mikrolitrów płynu z rzędu 11.

Dodać 100 mikrolitrów rozcieńczonej ujemnej i dodatniej surowicy do każdego odpowiedniego dołka w wierszu 12, zgodnie z szablonem próbki. Szczelnie zamknąć płytkę ELISA folią spożywczą i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. W międzyczasie rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe przeciwko mysim IgG HRP 10 000 razy, dodając PBST. Po godzinnej inkubacji umyć płytkę ELISA 300 mikrolitrami PBST na studzienkę, aby oczyścić niezwiązane przeciwciała. Następnie dodaj 100 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała drugorzędowego do każdej studzienki i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 40 minut.

Umyj płytkę 300 mikrolitrami PBST na dołek. Następnie dodaj 100 mikrolitrów roztworu do tworzenia koloru TMB do każdego dołka. Umieść płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i z dala od światła na 10 minut. Następnie natychmiast zakończ reakcję 50 mikrolitrami 2-molowego kwasu siarkowego. Wykryj gęstość optyczną lub wartości OD przy 450 nanometrach za pomocą markera enzymatycznego w ciągu 15 minut po zakończeniu.