Test do pomiaru akumulacji fluorescencyjnej sondy antybiotykowej w komórkach bakteryjnych

Pobrać probówki zawierające próbki bakterii.

W badanej próbce dodaj cząsteczki inhibitora, aby zablokować pompę wypływu antybiotyku przez bakterie.

Odwirować i wyrzucić supernatant.

Dodaj sondy antybiotykowe sprzężone z fluoroforem, które dostają się do komórek bakteryjnych.

W próbce kontrolnej pompa wypływowa wytłacza sondy do podłoża zewnątrzkomórkowego.

W próbce poddanej działaniu inhibitora zablokowana pompa wypływowa nie może wydalić sond, powodując ich akumulację.

Odwirować próbki. Odrzucić supernatant zawierający sondy zewnątrzkomórkowe.

Dodaj bufor do lizy, a następnie lizozym, aby osłabić ścianę komórkową bakterii.

Wykonaj cykle zamrażania i rozmrażania, sonikacji i ekspozycji na wysoką temperaturę, aby lizować komórki.

wirówka. Przenieść supernatant do membrany filtracyjnej.

Przemyć i zebrać filtrat zawierający sondy.

Zmierzyć intensywność fluorescencji filtratu.

Wyższa intensywność fluorescencji w próbkach bakteryjnych traktowanych inhibitorami sugeruje utratę funkcji wypływu, co prowadzi do akumulacji sondy wewnątrzkomórkowej.

W celu analizy akumulacji sondy, rozprowadź zapasy glicerolu szczepów bakteryjnych na płytkach agarowych LB w celu inkubacji przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego ranka wybierz pojedynczą kolonię z talerza do hodowli przez noc w bulionie lizogenicznym w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego ranka rozcieńczyć nocną kulturę około 50-krotnie w świeżej pożywce.

Gdy kultura osiągnie fazę mid-log, należy granulować bakterie przez odwirowanie i zdekantować pożywkę. Ponownie zawiesić bakterie w 1 mililitrze PBS i ponownie odwirować bakterie. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić przemyty osad w PBS do gęstości optycznej 600 nanometrów dwóch.

Dodaj 10,1 mikrolitra 10 milimolowego CCCP w PBS do 1 mililitra bakterii i inkubuj bakterie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Pod koniec inkubacji zebrać bakterie przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w 1 mililitrze 10-100 mikromolowego fluorescencyjnego roztworu antybiotyku w PBS.

Po 30-minutowej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza umyj komórki przez odwirowanie cztery razy w 1 mililitrze zimnego PBS na pranie. Po umyciu poddać bakterie lizie za pomocą 180 mikrolitrów buforu do lizy i 70 mikrolitrów lizozymu.

Po 30 minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza trzykrotnie zamroź i rozmroź bakterie w temperaturze minus 78 stopni Celsjusza przez 5 minut i 34 stopnie Celsjusza przez 15 minut. Po ostatniej rundzie zamrażania i rozmrażania, sonikować próbkę przez 20 minut, a następnie 30-minutową inkubację w temperaturze 65 stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji zebrać zlizowaną próbkę przez odwirowanie i przecedzić zawartość probówki przez 10-kilodaltonową membranę filtracyjną. Umyj filtr cztery razy 100 mikrolitrami wody na pranie i podziel każde płukanie do indywidualnych dołków czarnej 96-dołkowej płytki z płaskim dnem. Następnie zmierz natężenie fluorescencji na czytniku płytkowym o długościach fal wzbudzenia i emisji odpowiednich dla fluoroforu.