Test do pomiaru akumulacji fluorescencyjnej sondy antybiotykowej w komórkach bakteryjnych
JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 4:02 min. • July 8th, 2025
Pobrać probówki zawierające próbki bakterii.
W badanej próbce dodaj cząsteczki inhibitora, aby zablokować pompę wypływu antybiotyku przez bakterie.
Odwirować i wyrzucić supernatant.
Dodaj sondy antybiotykowe sprzężone z fluoroforem, które dostają się do komórek bakteryjnych.
W próbce kontrolnej pompa wypływowa wytłacza sondy do podłoża zewnątrzkomórkowego.
W próbce poddanej działaniu inhibitora zablokowana pompa wypływowa nie może wydalić sond, powodując ich akumulację.
Odwirować próbki. Odrzucić supernatant zawierający sondy zewnątrzkomórkowe.
Dodaj bufor do lizy, a następnie lizozym, aby osłabić ścianę komórkową bakterii.
Wykonaj cykle zamrażania i rozmrażania, sonikacji i ekspozycji na wysoką temperaturę, aby lizować komórki.
wirówka. Przenieść supernatant do membrany filtracyjnej.
Przemyć i zebrać filtrat zawierający sondy.
Zmierzyć intensywność fluorescencji filtratu.
Wyższa intensywność fluorescencji w próbkach bakteryjnych traktowanych inhibitorami sugeruje utratę funkcji wypływu, co prowadzi do akumulacji sondy wewnątrzkomórkowej.
W celu analizy akumulacji sondy, rozprowadź zapasy glicerolu szczepów bakteryjnych na płytkach agarowych LB w celu inkubacji przez noc w temperat
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych