Izolowanie niezmiennych limfocytów T NK z modelu mysiego

Zacznij od dootrzewnowego wstrzyknięcia syntetycznego glikolipidu myszy.

Komórki prezentujące antygen lub APC internalizują glikolipid i prezentują go za pośrednictwem nieklasycznej cząsteczki MHC CD1d.

APC migrują do śledziony i oddziałują z niezmiennymi limfocytami T NK lub komórkami iNKT, indukując aktywację i proliferację komórek iNKT.

Zbierz śledzionę. Mechanicznie go dysocjować, aby wytworzyć zawiesinę jednokomórkową.

Przenieś komórki do probówki. Dodaj pożywkę o gradiencie gęstości i odwiruj, aby oddzielić limfocyty.

Zbierz limfocyty. Dodaj tetramery CD1d znakowane antygenem glikolipidowym, znakowane fluoroforem, które oddziałują z komórkami iNKT.

Usuń niezwiązane tetramery. Nakładka z mikrokulkami magnetycznymi, które wiążą się z fluoroforami połączonymi z tetramerami.

Usuń niezwiązane kulki i załaduj zawiesinę ogniwa na kolumnę magnetyczną.

Pod wpływem pola magnetycznego komórki iNKT związane z koralikami są zatrzymywane w kolumnie, podczas gdy pozostałe komórki przepływają przez nią.

Usuń kolumnę z pola magnetycznego. Dodaj bufor elucyjny, aby wymyć komórki iNKT.

Wstrzyknąć normalną mysz DBA/1 dootrzewnowo z alpha-GalCer, w dawce 0,1 miligrama na kilogram masy ciała. Trzy dni po modelowaniu, po znieczuleniu, wyizoluj śledzionę myszy. Przygotować zawiesinę jednokomórkową, przecinając i mieląc śledzionę na sicie o oczkach 200. Przemyć zawiesinę komórek PBS. Odwirować 200 razy g przez 5 minut i wyrzucić supernatant.

Ponownie zawiesić komórki z 1 mililitrem krwi pełnej i roztworu do rozcieńczania tkanek. Dodaj 3 mililitry pożywki do separacji limfocytów myszy, a następnie odwiruj komórki przez 20 minut, w ilości 300 razy g, w temperaturze pokojowej.

Aby oczyścić ogniwa iNKT, należy ponownie zawiesić od 10 do 7 ogniw w 100 mikrolitrach PBS o temperaturze 4 stopni Celsjusza. Dodaj 10 mikrolitrów CD1d Tetramer-PE załadowanego alfa-GalCer i inkubuj je w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 15 minut w ciemności. Umyj komórki dwukrotnie PBS i zawieś je ponownie w 80 mikrolitrach PBS. Dodaj 20 mikrolitrów mikrogranulek anty-PE i inkubuj je w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 20 minut w ciemności. Umyj je dwukrotnie PBS i ponownie zawieś komórki z 500 mikrolitrami PBS.

Umieść kolumnę sortującą w polu magnetycznym sortownika MACS i spłucz 500 mikrolitrami PBS. Dodać przygotowaną zawiesinę komórkową do kolumny sortującej, zebrać przepływ i trzykrotnie przepłukać buforem PBS. Usuń pole magnetyczne i dodaj 1 mililitr buforu PBS do kolumny sortującej. Szybko popchnij tłok pod stałym ciśnieniem, aby wprowadzić oznakowane komórki do probówki zbiorczej i uzyskać oczyszczone komórki iNKT. Licz za pomocą automatycznego licznika komórek.