Wzmacnianie transdukcji wirusa w komórkach NK za pomocą polimeru kationowego

Weźmy na przykład komórki NK (natural killer). Dodaj wektory lentiwirusowe składające się z enzymów wirusowych i zmodyfikowanych cząsteczek RNA, które kodują białko fluorescencyjne.

Dodaj polimery kationowe i osadź komórki i wirusy.

Polimery neutralizują ładunki ujemne zarówno wirusa, jak i komórki, ułatwiając fuzję błonową.

RNA jest odwrotnie transkrybowane do DNA i integrowane z genomem gospodarza, umożliwiając ekspresję białek fluorescencyjnych.

Dodaj pożywkę uzupełnioną cytokiną interleukiną-2 lub IL-2.

IL-2 wyzwala sygnalizację wewnątrzkomórkową, która sprzyja przeżyciu i proliferacji komórek NK przy jednoczesnym zachowaniu ekspresji transgenu.

Przenieś mieszaninę do dobrze pokrytej przeciwciałami, które wiążą się ze specyficznymi immunoreceptorami na komórkach NK, pobudzając je do uwalniania cytokin przeciwwirusowych.

Określ ilościowo uwolnione cytokiny, aby ocenić wpływ polimeru na produkcję cytokin.

Dodaj barwniki fluorescencyjne, aby oznaczyć DNA komórek martwiczych.

Za pomocą cytometrii przepływowej zidentyfikuj żywe komórki i określ ilościowo sygnał białka fluorescencyjnego, aby zmierzyć wydajność transdukcji indukowanej przez polimer

.

Zawiesić mysie lub ludzkie pierwotne komórki NK w studzienkach 24-dołkowej płytki o stężeniu 0,5 x^10,5 na mililitr pożywki z supernatantem lentiwirusa GFP przy MOY 5, 10 i 20 oraz w obecności polibrenu, siarczanu protaminy lub dekstranu.

Odwirować płytki z prędkością 1000 razy g przez 60 minut. Następnie, bez dekantacji supernatantu, hoduj komórki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza nasączonym 5,2% dwutlenkiem węgla przez noc. Po umyciu ogniw 10 mililitrami PBS należy użyć 2 mililitrów pożywki RPMI 1640 z IL-2 w celu ponownego zawieszenia ogniw.

Dzień przed pobraniem komórek pokryj 96-dołkowe, wysoce białkowe płytki polistyrenowe 2,5 mikrograma na mililitr przeciwciał monoklonalnych anty-NKG2D i inkubuj płytki w temperaturze pokojowej lub w lodówce przez noc. Następnego dnia użyj 100 mikrolitrów PBS do trzykrotnego umycia każdej studzienki.

Zbierz transdukowane komórki NK, najpierw delikatnie stukając w płytki. Następnie dodaj 100 mikrolitrów komórek do każdego dołka z 96-dołkowych płytek. 16 do 18 godzin po aktywacji użyj pipety wielokanałowej, aby zebrać supernatanty. Następnie, używając rekombinowanych cytokin z zestawu ELISA, wygeneruj krzywą wzorcową i określ ilościowo cytokiny, takie jak interferon-gamma w supernatancie.

Aby przetestować żywotność komórek NK, cztery dni po transdukcji przemyj komórki 10 mililitrami zimnego PBS dwa razy. Następnie zbierz komórki i użyj aneksyny-V/7-amino-aktynomycyny D, aby je wybarwić. Użyj cytometrii przepływowej, aby określić procent komórek martwiczych wśród przekształconych komórek NK i przeanalizować dane zgodnie z protokołem tekstowym.