JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 2:57 min. • July 8th, 2025
Zacznij od probówki zawierającej transkrybowane in vitro mRNA, które kodują białka zielonej fluorescencji.
mRNA zawiera zmodyfikowane nukleotydy, trifosforan 5-metylocytydyny i trifosforan pseudourydyny, które zapobiegają odpowiedzi immunologicznej i zwiększają stabilność mRNA.
Koniec 5' mRNA ulega defosforylacji, co uniemożliwia jego rozpoznanie przez receptory rozpoznawania wzorców na makrofagach.
Dodaj kationowy odczynnik transfekcji na bazie lipidów do mRNA, ułatwiając enkapsulację mRNA poprzez oddziaływania elektrostatyczne i tworząc kompleks.
Wprowadź kompleksy lipid-mRNA do wielodołkowej płytki z przylegającymi pierwotnymi makrofagami pochodzącymi od myszy i delikatnie mieszaj w celu równomiernego wymieszania.
Makrofagi internalizują kompleks zawierający mRNA do endosomu. Później kompleks łączy się z błoną endosomalną, uwalniając mRNA do cytoplazmy komórki.
Ogon poli-A na końcu 3' stabilizuje mRNA, które ulega syntezie białek w celu wytworzenia białek zielonej fluorescencji.
Pod mikroskopem fluorescencyjnym zielona fluorescencja w makrofagach sugeruje udaną transfekcję ze zmodyfikowanymi mRNA.
Przygotuj się do transfekcji, dodając wstępnie obliczoną objętość buforu do transf
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych