JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 2:57 min. • July 8th, 2025
Zacznij od probówki zawierającej transkrybowane in vitro mRNA, które kodują białka zielonej fluorescencji.
mRNA zawiera zmodyfikowane nukleotydy, trifosforan 5-metylocytydyny i trifosforan pseudourydyny, które zapobiegają odpowiedzi immunologicznej i zwiększają stabilność mRNA.
Koniec 5' mRNA ulega defosforylacji, co uniemożliwia jego rozpoznanie przez receptory rozpoznawania wzorców na makrofagach.
Dodaj kationowy odczynnik transfekcji na bazie lipidów do mRNA, ułatwiając enkapsulację mRNA poprzez oddziaływania elektrostatyczne i tworząc kompleks.
Wprowadź kompleksy lipid-mRNA do wielodołkowej płytki z przylegającymi pierwotnymi makrofagami pochodzącymi od myszy i delikatnie mieszaj w celu równomiernego wymieszania.
Makrofagi internalizują kompleks zawierający mRNA do endosomu. Później kompleks łączy się z błoną endosomalną, uwalniając mRNA do cytoplazmy komórki.
Ogon poli-A na końcu 3' stabilizuje mRNA, które ulega syntezie białek w celu wytworzenia białek zielonej fluorescencji.
Pod mikroskopem fluorescencyjnym zielona fluorescencja w makrofagach sugeruje udaną transfekcję ze zmodyfikowanymi mRNA.
Przygotuj się do transfekcji, dodając wstępnie obliczoną objętość buforu do transfekcji mRNA pomniejszoną o objętości odczynnika do transfekcji mRNA i mRNA do probówki reakcyjnej. Rozmrozić zapas mRNA i delikatnie go wymieszać, obracając probówkę. Następnie dodaj wstępnie obliczoną objętość mRNA do probówki reakcyjnej.
Odwirować i odwirować mieszaninę reakcyjną i odczynnik do transfekcji mRNA, a następnie dodać odpowiednią objętość odczynnika do transfekcji mRNA do probówki z mieszanką reakcyjną. Zwiruj probówkę i odkręć ją, a następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut. W międzyczasie zastąp pożywkę hodowlaną makrofagów świeżą, ciepłą pożywką hodowlaną.
Po zakończeniu inkubacji mieszaniny transfekcyjnej dodać mieszaninę do studzienek płytkowych zawierających makrofagi kroplami i po okręgu od zewnątrz do środka studzienki. Aby zapewnić równomierne rozprowadzenie mieszanki transfekcyjnej, delikatnie kołysz płytką w kierunku pionowym i poziomym.
Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez co najmniej sześć godzin. Po inkubacji przeanalizuj wydajność transfekcji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, cytometrii przepływowej lub immunoblot.
Najważniejszą częścią tej procedury jest zapewnienie równomiernego rozprowadzenia mieszaniny transfekcyjnej, tak aby wszystkie makrofagi miały kontakt z tą samą ilością mRNA.