JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 5:23 min. • July 8th, 2025
Zacznij od ludzkich komórek krwi pępowinowej, w tym hematopoetycznych komórek macierzystych CD34+ lub HSC.
Dodaj przeciwciała, aby zablokować komórkowe receptory Fc, zapobiegając niespecyficznemu wiązaniu kulek magnetycznych specyficznych dla HSC.
Wprowadzić kulki magnetyczne pokryte przeciwciałami skierowane do HSC CD34+. Odwirować i wyrzucić supernatant.
Ponownie zawieś komórki w buforze. Przepuścić je przez separator magnetyczny, aby zatrzymać HSC związane z koralikami; przepływają niezwiązane komórki.
Usuń pole magnetyczne, aby zebrać HSC.
Odwirować i ponownie zawiesić komórki w pożywce wzrostowej. Umieść komórki na płytce i inkubuj.
Pożywka zawiera czynniki wzrostu i cytokiny, które sprzyjają przetrwaniu i ekspansji HSC.
Zbierz komórki. Dodaj pożywkę do zamrażania, przenieś do kriowialu i zamroź.
Aby wytworzyć ludzki układ odpornościowy lub mysi model HIS, należy rozmrozić HSC. Dodaj je do wstępnie podgrzanego podłoża.
Odwirować i ponownie zawiesić komórki w buforze.
Komórki są gotowe do wstrzyknięcia do mleka myszy z niedoborem odporności w celu wygenerowania modelu HIS.
Na początek ponownie zawieś CD34-dodatni osad komórkowy wyizolowany z krwi pępowinowej w 300 mikrolitrach bufora magnetycznego separatora komórek na 1 x 108 komórek. Dodać 100 mikrolitrów odczynnika blokującego FcR na 1 x 108 komórek, a następnie 100 mikrolitrów CD34-dodatnich kulek magnetycznych na 1 x 108 komórek i inkubować w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 30 minut.
Następnie dodaj 5 mililitrów bufora magnetycznego separatora komórek na 1 x 108 komórek i wiruj w 360 g przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Powtórz etap płukania i ponownie zawieś osad w 500 mikrolitrach na 100 milionów komórek bufora magnetycznego separatora komórek w 15-mililitrowej stożkowej probówce oznaczonej jako "niefrakcjonowany". Oznacz dwie kolejne 15-mililitrowe rurki - CD34-ujemne i CD34-dodatnie. Umieść trzy probówki na stojaku chłodzącym.
Oddziel komórki za pomocą dwukolumnowego programu selekcji pozytywnej na automatycznym magnetycznym separatorze komórek w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Następnie, w celu rozprężenia i zamrożenia ludzkich komórek macierzystych CD34-dodatnich, należy przygotować krew pępowinową lub pożywkę CB zgodnie z opisem w manuskrypcie i przepuścić przez filtr 0,22 mikrona. Ponownie zawiesić komórki CD34-dodatnie w temperaturze 100 000 na mililitr pożywki CB i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
W trzecim dniu dodać do kolby równą objętość pożywki CB bez cytokin. Piątego dnia zbierz rozszerzone komórki CD34-dodatnie. Pipetować zawiesinę komórek w górę iw dół i zebrać w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów. Dodać tyle podłoża CB, aby pokryć dno kolby. Za pomocą skrobaka do komórek zeskrobać całe dno kolby. Zbierz wszystkie pożywki do tej samej 50-mililitrowej probówki i odwiruj.
Ponownie zawiesić komórki w 2 mililitrach pożywki CB i odwirować. Zassać pożywkę do osadu i ponownie zawiesić osad w podłożu zamrażającym. Następnie rozpocznij przygotowanie komórek CD34-dodatnich trzy godziny po napromieniowaniu szczeniąt. Podgrzej 10 mililitrów pożywki CB w 50-mililitrowej tubie.
Pobrać jedną fiolkę z ekspandowanymi i zamrożonymi komórkami CD34-dodatnimi in vitro na każde cztery do sześciu szczeniąt do wstrzyknięcia. Szybko rozmrozić w temperaturze od 50 do 55 stopni Celsjusza, aż będzie widoczna tylko niewielka ilość lodu, i dodaj komórki do podgrzanej pożywki CB. Użyj 1 mililitra pożywki do przepłukania każdej fiolki i wirowania komórek w temperaturze 360 g przez 12 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Ostrożnie zassać pożywkę. Ponownie zawiesić osad w 2 mililitrach pożywki CB i policzyć komórki. Ponownie odwirować komórki, odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach sterylnego PBS na n plus 1 młode do wstrzyknięcia, co daje od 250 000 do 450 000 komórek CD34-dodatnich na mysz.