JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 3:44 min. • July 8th, 2025
Weź dwie kuwety do elektroporacji. Jedna kuweta zawiera mały interferujący RNA lub siRNA, zaprojektowany w celu zahamowania produkcji FIP200, białka indukującego autofagię.
Druga kuweta zawiera zaszyfrowane siRNA jako kontrolę, która nie hamuje produkcji FIP200.
Dodaj niedojrzałe komórki dendrytyczne lub iDC; elektroporanuj w celu wejścia siRNA do komórki, a następnie płytkuj komórki.
Zinternalizowane siRNA wiąże się z indukującym RNA kompleksem wyciszającym.
Kompleks z siRNA specyficznym dla FIP200 rozszczepia docelowe mRNA, hamując produkcję FIP200, podczas gdy kontrolne iDC poddane działaniu siRNA wytwarzają FIP200.
Zbierz komórki i dodaj wirusa opryszczki pospolitej. Po fuzji błony komórkowej otoczki wirusa uwolnione DNA dostaje się do jądra i prowadzi do produkcji białek wirusowych i nukleokapsydów.
Białka wirusowe zaburzają laminy jądrowe. FIP200 tworzy kompleks, który uruchamia kaskadę sygnalizacyjną, indukując autofagię uszkodzonych laminy w celu ich degradacji i ułatwiając ucieczkę wirusowych nukleokapsydów do cytoplazmy.
Hamowanie produkcji FIP200 za pośrednictwem siRNA ogranicza autofagię laminy, zapobiegając ucieczce nukleokapsydu.
Komórki są gotowe do oceny indukowanego przez siRNA hamowania autofagii.
W 3,5 dniu po przyklejeniu przenieś 12 milionów iDC do 50-mililitrowej probówki. Odwirować je w ilości 300 razy g przez 5 minut, a następnie wyrzucić supernatant. Równolegle wykonaj analizę cytometrii przepływowej w celu monitorowania stanu dojrzewania.
Delikatnie umyj iDC w 5 mililitrach OptiMEM bez czerwieni fenolowej i odwiruj je w ilości 300 razy g przez 5 minut. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś komórki w 200 mikrolitrach OptiMEM, dostosowując stężenie komórek do 6 milionów komórek na 100 mikrolitrów.
Dodaj 75 pikamoli specyficznego dla FIP200 lub zakodowanego siRNA do 4-milimetrowych kuwet elektrod i przenieś 100 mikrolitrów zawiesiny ogniw do odpowiedniej kuwety. Bezpośrednio pulsuj iDC za pomocą aparatu do elektroporacji.
Po elektroporacji przenieś iDC na sześciodołkowe płytki ze świeżym, wstępnie podgrzanym podłożem DC, wysiewając komórki w końcowym stężeniu 1 miliona komórek na mililitr i umieść je w inkubatorze. Po 48 godzinach zbadaj pod mikroskopem morfologię elektroporowanych iDC, a następnie zbierz ogniwa za pomocą skrobaka do komórek i przenieś je do 15-mililitrowych probówek.
Przepłukać studzienki 1 mililitrem PBS uzupełnionym 0,01% EDTA i przenieść roztwór do odpowiednich probówek. Następnie podziel komórki dla każdego warunku siRNA, jak opisano w manuskrypcie.
Użyj 500 000 komórek, aby ocenić stan dojrzewania i żywotność komórek. Użyj 1 miliona komórek do analizy western blot, aby zweryfikować 200 specyficznych skuteczności knockdownu, a pozostałe komórki użyj do eksperymentów z infekcją HSV-1.