Terapia komórkowa autoimmunologicznego zapalenia stawów w modelu mysim
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 wyświetleń • 3:52 min • July 8th, 2025
Weźmy limfocyty T regulatorowe pochodzące z iPSC lub Treg, wyrażające receptory specyficzne dla albuminy jaja kurzego. Wstrzyknij je do żyły ogonowej skrępowanej myszy.
Komórki docierają do błony maziowej wyściełającej wewnętrzną powierzchnię torebki stawu kolanowego.
Następnie podać metylowaną albuminę surowicy bydlęcej lub mBSA, zemulgowaną adiuwantem.
Adiuwanty poprawiają prezentację mBSA komórkom prezentującym antygen lub APC, które przetwarzają i prezentują fragmenty za pośrednictwem cząsteczek MHC.
APC migrują do węzłów chłonnych, indukując aktywację limfocytów T. Aktywowane limfocyty T migrują do stawu kolanowego.
Wstrzyknąć mBSA w monoterapii i mBSA z albuminą jaja kurzego odpowiednio w lewy i prawy staw kolanowy.
W lewym kolanie APC prezentują fragmenty mBSA aktywowanym limfocytom T, wyzwalając uwalnianie cytokin prozapalnych i prowadząc do uszkodzenia tkanek i obrzęku stawów, zwanego zapaleniem stawów.
W prawym kolanie limfocyty Treg oddziałują z APC prezentującymi albuminę jaja kurzego i uwalniają cytokiny przeciwzapalne, zmniejszając uszkodzenia tkanek i obrzęk stawów, łagodząc w ten sposób zapalenie stawów.
Zacznij od odłączenia interesujących kultur komórkowych za pomocą trypsyny i ponownego zawieszenia każdego typu komórek w 10 mililitrach świeżej pożywki. Umieść każdą kulturę komórkową w nowym 10-centymetrowym naczyniu i pozwól komórkom zasilającym przylegać do inkubatora do hodowli komórkowych. Po 30 minutach zbierz pływające iPSC i przepuść kultury przez indywidualne sitka do komórek o średnicy 70 mikronów, aby usunąć klastry komórek do zliczenia.
Zawiesić każdą kulturę w stężeniu 1,5 x 107 komórek na mililitr w zimnym PBS, ponownie filtrując w razie potrzeby. Następnie umieść 4-6 tygodniowe samice myszy C57BL6 pojedynczo w unieruchomieniu dla małych zwierząt i adoptuj przenieś 200 mikrolitrów jednego rodzaju komórek na mysz do żyły ogonowej każdego zwierzęcia.
Użyj suwmiarki z czujnikiem zegarowym, aby zmierzyć obrzęk obu kolan, aby ustalić pomiar podstawowy. 10 dni po transferze komórek użyj 1-mililitrowej strzykawki, aby wstrzyknąć myszom 100 mikrogramów metylowanego BSA zemulgowanego w kompletnym adiuwant Freunda u podstawy ogona każdego zwierzęcia doświadczalnego.
17 dni po transferze komórek wywołać zapalenie stawów poprzez dostawowe wstrzyknięcie 20 mikrogramów metylowanego BSA w 10 mikrolitrach PBS do lewego stawu kolanowego i 20 mikrogramów metylowanego BSA oraz 100 mikrogramów całej albuminy jaja kurzego w 10 mikrolitrach PBS do prawego stawu kolanowego każdego znieczulonego adoptowanego zwierzęcia.
Siedem dni po wywołaniu zapalenia stawów ponownie zmierz kolana, aby obliczyć procentowy wzrost średnicy kolana i chirurgicznie wyciąć rzepki. Zamocuj stawy w formalinie. Następnie, po odwapnieniu w EDTA, zanurz kolana w parafinie i uzyskaj 4-mikronowe skrawki do barwienia i analizy histochemicznej.
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje rolę limfocytów T regulatorowych (Tregs) pochodzących z iPSC w modulowaniu zapalenia stawów w modelu mysim. Poprzez wstrzykiwanie Tregs oraz zmetylowanej albuminy surowicy bydlęcej (mBSA), praca bada przeciwstawne efekty limfocytów Tregs i aktywowanych limfocytów T na stan zapalny stawów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Biologia komórki
- Neuronauka
Wstęp
- Regulacyjne limfocyty T (Tregs) odgrywają kluczową rolę w utrzymywaniu tolerancji immunologicznej.
- Zapalenie stawów charakteryzuje się stanem zapalnym stawów i uszkodzeniem tkanek.
- Metylowana seryjnie albumina bydlęca (mBSA) jest stosowana do indukcji zapalenia stawów w modelach eksperymentalnych.
- Zrozumienie funkcji Tregs może dostarczyć wiedzy na temat strategii terapeutycznych w chorobach autoimmunologicznych.
Cel badania
- Ocena wpływu Treg pochodnych iPSC na progresję zapalenia stawów.
- Porównanie odpowiedzi zapalnych w obecności i w nieobecności Treg.
- Wyjaśnienie mechanizmów, dzięki którym Treg łagodzą zapalenie stawów.
Zastosowane metody
- Izolacja i hodowla Treg pochodzących z iPSC.
- Iniekcja Treg do żyły ogonowej unieruchomionych myszy.
- Indukcja zapalenia stawów przy użyciu mBSA w stawach kolanowych.
- Pomiar obrzęku stawów oraz analiza histologiczna po zakończeniu eksperymentu.
Główne wyniki
- Aktywowane limfocyty T wywołały znaczny obrzęk i stan zapalny stawów.
- Limfocyty Treg ograniczyły stan zapalny i uszkodzenia tkanek w obecności owalbuminy.
- Analiza histologiczna potwierdziła działanie ochronne limfocytów Treg w obrębie tkanek stawowych.
- Poziomy cytokin prozapalnych były podwyższone w przypadku braku limfocytów Treg.
Wnioski
- Treg pochodne z iPSC skutecznie łagodzą objawy artretyzmu u myszy.
- Wyniki te podkreślają potencjał komórek Treg w zastosowaniach terapeutycznych w chorobach autoimmunologicznych.
- Dalsze badania są niezbędne, aby zgłębić mechanizmy leżące u podstaw ochrony zapośredniczonej przez Treg.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejsze badanie przedstawia podejście komórkowe do modulacji autoimmunologicznego zapalenia stawów poprzez wykorzystanie antygenowo swoistych limfocytów T regulatorowych do ukierunkowanego tłumienia stanu zapalnego. Model ten umożliwia mechaniczną redukcję ryzyka w strategiach tolerancji zapśredniczonej przez komórki Treg, co zwiększa wiarygodność prognostyczną we wczesnej fazie opracowywania immunoterapii. Stanowi on platformę translacyjną do oceny antygenowo swoistej regulacji immunologicznej w przedklinicznych modelach zapalenia stawów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie funkcji swoistych dla antygenu komórek Treg w supresji patogennych odpowiedzi limfocytów T w autoimmunologicznym zapaleniu stawów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zdefiniowany system do walidacji mechanizmów tolerancji immunologicznej zależnej od komórek Treg przed wyborem wiodącego kandydata.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie ilościowych odczytów obrzęku stawów oraz zmian histologicznych w celu oceny wpływu terapeutycznego interwencji z użyciem komórek Treg.
- Wartość operacyjna: Ustanawia powtarzalny format testu in vivo do porównywania efektów przeciwzapalnych terapii opartych na komórkach w różnych grupach eksperymentalnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera ocenę migracji komórek Treg, rozpoznawania antygenów oraz modulacji cytokin w mikrośrodowisku maziówkowym istotnym dla przebiegu choroby.
- Wartość operacyjna: Ułatwia przedkliniczną ocenę dawki, czasu podania oraz swoistości antygenowej terapii opartych na komórkach Treg we wskazaniach autoimmunologicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta sytuuje generowanie i testowanie antygenowo-specyficznych komórek Treg w ramach kontinuum odkrywania immunoterapii, łącząc walidację celu z przedkliniczną oceną skuteczności w modelach chorób autoimmunologicznych.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących antygenowo zależnego hamowania zapalenia autoimmunologicznego w stawach przez komórki Treg.
- Przesiewanie: Dostarcza zestandaryzowanych, mierzalnych wskaźników stanu zapalnego w celu porównania skuteczności komórek Treg w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Analityka: Zapewnia dane histopatologiczne i morfometryczne wspierające interpretację mechanistyczną modulacji immunologicznej.
- Badania translacyjne: Łączy funkcjonalność komórek Treg pochodzących z iPSC z walidacją przedkliniczną w mysim modelu zapalenia stawów indukowanego antygenem.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę do iteracyjnego testowania specyficznych dla antygenu konstruktów Treg w modelach chorób autoimmunologicznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Mechanistyczna redukcja ryzyka w terapiach Treg specyficznych dla antygenu poprzez bezpośrednią ocenę tłumienia stanu zapalnego w tkance docelowej.
- Wartość operacyjna: Zstandaryzowane procedury transferu komórek, stymulacji antygenowej i fenotypowania stawów zwiększają powtarzalność między badaniami.
- Wartość strategiczna: Umożliwia wczesne podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu projektu (go/no-go) w oparciu o zależną od antygenu skuteczność komórek Treg in vivo.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów Treg z określoną specyficznością antygenową w wskazaniach autoimmunologicznych z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Doświadczenie w różnicowaniu iPSC, fenotypowaniu Treg oraz inżynierii receptorów antygenowych.
- Dostęp do mysich modeli zapalenia stawów, technik wstrzykiwania dostawowych oraz narzędzi do pomiaru obrzęku stawów.
- Standaryzacja dawkowania antygenów, stosowania adiuwantów oraz dawkowania Treg w grupach eksperymentalnych.
- Kwestie adaptacyjne w przypadku stosowania alternatywnych antygenów lub modeli autoimmunologicznych poza systemami mBSA-owalbumina.
- Ograniczenia praktyczne obejmują zależność od antygenów specyficznych dla modelu oraz zmienność w wydajności engraftmentu i migracji Treg.
Najczęściej zadawane pytania z zakresu biofarmacji
In vitro Różnicowanie ludzkich limfocytów T regulatorowych indukowanych CD4 + FOXP3 + (iTreg) od naiwnych limfocytów T CD4 + przy użyciu protokołu zawierającego TGF-β
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Wzbogacanie i rozszerzanie rzadkich limfocytów T specyficznych dla antygenu za pomocą nanocząstek magnetycznych
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Augmentacja in vivo indukcji regulatorowych limfocytów T naprowadzających się na jelita
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Technika generowania mysiego modelu zapalenia stawów wywołanego adiuwantem
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Rozwój limfocytów T regulatorowych specyficznych dla antygenu macierzystego przeciwko autoimmunizacji
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Immunoterapia adoptywna komórek iNKT u myszy RZS indukowanych izomerazą glukozo-6-fosforanową (G6PI)
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Protokół krio-proszkowania do przetwarzania łap myszy w celu oceny molekularnych szlaków zapalenia tkanek w modelu zapalenia stawów wywołanego kolagenem
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Analiza cytometrii przepływowej podzbiorów komórek odpornościowych w mysiej śledzionie, szpiku kostnym, węzłach chłonnych i tkance maziowej w modelu choroby zwyrodnieniowej stawów
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Izolacja i hodowla pierwotnych makrofagów maziowych i fibroblastów z mysiej tkanki zapalenia stawów
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Model murinowy immunomodulacji indukowanej przez skórę
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Ostatnia aktualizacja: 29 sierpnia 2026