JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 wyświetleń • 3:52 min • July 8th, 2025
Weźmy limfocyty T regulatorowe pochodzące z iPSC lub Treg, wyrażające receptory specyficzne dla albuminy jaja kurzego. Wstrzyknij je do żyły ogonowej skrępowanej myszy.
Komórki docierają do błony maziowej wyściełającej wewnętrzną powierzchnię torebki stawu kolanowego.
Następnie podać metylowaną albuminę surowicy bydlęcej lub mBSA, zemulgowaną adiuwantem.
Adiuwanty poprawiają prezentację mBSA komórkom prezentującym antygen lub APC, które przetwarzają i prezentują fragmenty za pośrednictwem cząsteczek MHC.
APC migrują do węzłów chłonnych, indukując aktywację limfocytów T. Aktywowane limfocyty T migrują do stawu kolanowego.
Wstrzyknąć mBSA w monoterapii i mBSA z albuminą jaja kurzego odpowiednio w lewy i prawy staw kolanowy.
W lewym kolanie APC prezentują fragmenty mBSA aktywowanym limfocytom T, wyzwalając uwalnianie cytokin prozapalnych i prowadząc do uszkodzenia tkanek i obrzęku stawów, zwanego zapaleniem stawów.
W prawym kolanie limfocyty Treg oddziałują z APC prezentującymi albuminę jaja kurzego i uwalniają cytokiny przeciwzapalne, zmniejszając uszkodzenia tkanek i obrzęk stawów, łagodząc w ten sposób zapalenie stawów.
Zacznij od odłączenia interesujących kultur komórkowych za pomocą trypsyny i ponownego zawieszenia każdego typu komórek w 10 mililitrach świeżej pożywki. Umieść każdą kulturę komórkową w nowym 10-centymetrowym naczyniu i pozwól komórkom zasilającym przylegać do inkubatora do hodowli komórkowych. Po 30 minutach zbierz pływające iPSC i przepuść kultury przez indywidualne sitka do komórek o średnicy 70 mikronów, aby usunąć klastry komórek do zliczenia.
Zawiesić każdą kulturę w stężeniu 1,5 x 107 komórek na mililitr w zimnym PBS, ponownie filtrując w razie potrzeby. Następnie umieść 4-6 tygodniowe samice myszy C57BL6 pojedynczo w unieruchomieniu dla małych zwierząt i adoptuj przenieś 200 mikrolitrów jednego rodzaju komórek na mysz do żyły ogonowej każdego zwierzęcia.
Użyj suwmiarki z czujnikiem zegarowym, aby zmierzyć obrzęk obu kolan, aby ustalić pomiar podstawowy. 10 dni po transferze komórek użyj 1-mililitrowej strzykawki, aby wstrzyknąć myszom 100 mikrogramów metylowanego BSA zemulgowanego w kompletnym adiuwant Freunda u podstawy ogona każdego zwierzęcia doświadczalnego.
17 dni po transferze komórek wywołać zapalenie stawów poprzez dostawowe wstrzyknięcie 20 mikrogramów metylowanego BSA w 10 mikrolitrach PBS do lewego stawu kolanowego i 20 mikrogramów metylowanego BSA oraz 100 mikrogramów całej albuminy jaja kurzego w 10 mikrolitrach PBS do prawego stawu kolanowego każdego znieczulonego adoptowanego zwierzęcia.
Siedem dni po wywołaniu zapalenia stawów ponownie zmierz kolana, aby obliczyć procentowy wzrost średnicy kolana i chirurgicznie wyciąć rzepki. Zamocuj stawy w formalinie. Następnie, po odwapnieniu w EDTA, zanurz kolana w parafinie i uzyskaj 4-mikronowe skrawki do barwienia i analizy histochemicznej.