JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 wyświetleń • 4:42 min • July 8th, 2025
Weźmy wektory retrowirusowe zmieszane z pierwotnymi komórkami śledziony.
Wektory zawierają transgeniczne RNA kodujące chimeryczny receptor antygenowy lub CAR, który jest ukierunkowany na antygen specyficzny dla nowotworu.
Cytokina interleukina-2 w pożywce selektywnie promuje proliferację limfocytów T, podczas gdy inne komórki ostatecznie umierają.
Przenieść mieszaninę na mikropłytkę pokrytą rekombinowanymi fragmentami fibronektyny.
Wirować, aby ułatwić fragmentom fibronektyny wiązanie wektorów i limfocytów T, pośrednicząc w interakcji wirus-komórka gospodarza, i inkubować.
Po fuzji otoczki wektorów z błoną komórkową enzymy wirusowe dokonują odwrotnej transkrypcji uwolnionego RNA do DNA i włączają go do genomu gospodarza.
Transdukowane limfocyty T wyrażają powierzchniowo związane CAR, składające się z zewnątrzkomórkowego zmiennego fragmentu przeciwciała ukierunkowanego na antygen specyficzny dla nowotworu i wewnątrzkomórkowe regiony sygnalizacyjne w odpowiedzi na antygen.
Ponownie zawieś komórki przed przeniesieniem ich do probówki.
Odwirować w celu odrzucenia supernatantu zawierającego niezinternalizowane wirusy i ponownie zawiesić komórki w buforze do dalszych testów.
Następnego dnia po splenektomii należy przygotować PBS zawierający 25 mikrogramów na mililitr rekombinowanego ludzkiego fragmentu fibronektyny lub RHFF i pokryć 24-dołkowe płytki niepoddane hodowli tkankowej, dodając 0,5 mililitra roztworu do każdej studzienki. Następnego dnia usuń roztwór ze studzienek i dodaj 1 mililitr na studzienkę 2% BSA w PBS.
Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut, a następnie usunąć BSA, mocno przewracając płytkę przed dodaniem 2 mililitrów PBS do umycia. Po zebraniu supernatantu wirusa z komórek HEK293T, dodaj świeży TCM do końcowej objętości w mililitrach równej liczbie studzienek pokrytych RHFF plus dodatkowe 3 mililitry.
Wyjąć wyhodowane splenocyty z inkubatora i ponownie zawiesić, delikatnie pipetując w górę i w dół dwa do trzech razy w każdym dołku. Przenieś zawiesiny komórek do 50-mililitrowej stożkowej probówki. Następnie ponownie zawieś splenocyty w supernatancie wirusa do 1 x 106 komórek na mililitr.
Następnie dodaj 1 mililitr zawiesiny splenocytów na studzienkę do dołków płytek pokrytych RHFF. Teraz obracaj płytki przez 90 minut w temperaturze 32 stopni Celsjusza i 770 gs z przyspieszeniem 4 i ustawieniem przerwy na zero. Podczas wirowania przygotuj 50 jednostek międzynarodowych na mililitr rekombinowanej ludzkiej IL-2 w TCM.
Po odwirowaniu dodaj 1 mililitr pożywki do każdej studzienki na płytkach i inkubuj przez noc. Jeśli limfocyty T osiągną więcej niż 80% konfluencji, podziel komórki, delikatnie pipetując w górę iw dół w każdej studzience, dwa do trzech razy, a następnie przenieś 1 mililitr z każdej studzienki do nowych dołków świeżej 24-dołkowej płytki poddanej działaniu kultur tkankowych.
Dodaj 1 mililitr świeżego TCM, z 50 jednostkami międzynarodowymi na mililitr IL-2 do każdego dołka. Jeśli komórki nie osiągną konfluencji większej niż 80%, zmień połowę pożywki, powoli odpipetowując 1 mililitr pożywki z góry każdej studzienki i zastępując ją 1 mililitrem świeżego TCM, zawierającego 50 jednostek międzynarodowych na mililitr rekombinowanej ludzkiej IL-2.
Ponownie zawiesić limfocyty CAR T, delikatnie pipetując w górę i w dół trzy razy w każdym dołku, a następnie przenieść do 250-mililitrowej probówki wirówkowej. Wiruj komórki z prędkością 300 gs przez 10 minut. Następnie całkowicie zassać supernatant bez naruszania osadu. Użyj PBS do umycia komórek, a następnie policz je przed ponownym umyciem. Typowa wydajność limfocytów CAR T wynosi około 1 x 106 komórek na dołek.