Genetyczna modyfikacja limfocytów CAR T przy użyciu systemu CRISPR-Cas9

Rozpocznij od zawieszenia limfocytów T i potraktuj je lentiwirusami CAR przenoszącymi gen receptora antygenu chimerycznego lub lentiwirusów CAR i CRISPR.

lentiwirus CRISPR zawiera geny przewodnika RNA i nukleazy Cas9, a także gen oporności na antybiotyki.

Zarówno lentiwirusy CAR, jak i CRISPR oddziałują z limfocytami T i uwalniają ich RNA.

Te RNA są odwrotnie transkrybowane i przekształcane w odpowiednie DNA, które integruje się z DNA komórek T.

Umożliwia to syntezę białek CAR, przewodnikowych RNA i białek Cas9.

Przewodnik RNA tworzy kompleks z Cas9, który specyficznie rozpoznaje i wiąże się z docelowym genem w DNA komórek T.

Tymczasem Cas9 rozszczepia DNA, tworząc dwuniciowe pęknięcie.

Przerwa ta jest naprawiana przez niehomologiczne łączenie końców, podatny na błędy mechanizm naprawy, powodujący modyfikację genu docelowego.

W ten sposób powstają genetycznie zmodyfikowane limfocyty T z chimerycznymi receptorami antygenowymi.

Leczenie komórek antybiotykami w celu wyeliminowania niezmodyfikowanych limfocytów T i selektywnej izolacji genetycznie zmodyfikowanych limfocytów CAR T.

Aby zakłócić czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów, należy użyć przewodnika RNA, jak opisano w manuskrypcie. Inkubować odczynniki do transfekcji w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po inkubacji dodaj je do komórek 293T, które osiągnęły konfluencję od 70% do 90%, i hoduj transfekowane komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% CO₂ w celu wytworzenia lentiwirusa.

Po 24 i 48 godzinach zebrać i zagęścić supernatant zawierający wirusa przez ultrawirowanie w 50-mililitrowych probówkach ultrawirówek i zamrozić w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości. Następnie, pierwszego dnia, delikatnie ponownie zawieś limfocyty T, aby rozbić rozety.

W laboratorium zatwierdzonym przez BSL-2 plus, aby wygenerować limfocyty T Car, dodaj lentiwirusa CAR19 i lentiwirusa CRISPR ukierunkowanego na GM-CSF do stymulowanych limfocytów T. W trzecim i piątym dniu, w celu pomyślnej transdukcji limfocytów T edytowanych przez lenti-CRISPR wykazujących oporność na puromycynę, należy potraktować komórki dichlorowodorkiem puromycyny w stężeniu 1 mikrograma puromycyny na mililitr.