Technika CRISPR-Cas9 do edycji genów w limfocytach T

Weźmy limfocyty T zawieszone w podłożu odpowiednim do elektroporacji, procesu, w którym impulsy elektryczne tworzą tymczasowe pory w błonie komórkowej.

Dodaj kompleksy zawierające białko Cas9 i pojedynczy przewodnik RNA lub sgRNA. sgRNA to mały RNA, który kieruje Cas9, nożyczki molekularne, do określonego miejsca na DNA w celu cięcia.

Dodaj krótkie jednoniciowe cząsteczki DNA, które pomagają w transporcie kompleksów Cas9-sgRNA do komórki.

Przenieś tę mieszaninę do kuwety i rozpocznij elektroporację, stosując krótkie impulsy elektryczne.

Proces ten pozwala kompleksom dostać się do komórki.

sgRNA wiąże się z miejscem docelowym w DNA komórek T, umożliwiając Cas9 edycję DNA, tworząc przerwę w obu niciach.

To zakłócenie sygnalizuje białkom naprawczym dotarcie do tego miejsca.

Białka naprawcze następnie ponownie łączą końce, co sprawia, że gen przestaje działać.

Inkubować limfocyty T z edytowanymi genami w odpowiednim podłożu do dalszych testów.

Przygotować rybonukleoproteinę lub kompleks RNP, inkubując 10 mikrogramów nukleazy Cas9 z 5 mikrogramami pojedynczego prowadzącego RNA przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Dołącz symulowaną kontrolę bez pojedynczego prowadzącego RNA. Połącz z