JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 wyświetleń • 2:30 min • July 8th, 2025
Weźmy limfocyty T zawieszone w podłożu odpowiednim do elektroporacji, procesu, w którym impulsy elektryczne tworzą tymczasowe pory w błonie komórkowej.
Dodaj kompleksy zawierające białko Cas9 i pojedynczy przewodnik RNA lub sgRNA. sgRNA to mały RNA, który kieruje Cas9, nożyczki molekularne, do określonego miejsca na DNA w celu cięcia.
Dodaj krótkie jednoniciowe cząsteczki DNA, które pomagają w transporcie kompleksów Cas9-sgRNA do komórki.
Przenieś tę mieszaninę do kuwety i rozpocznij elektroporację, stosując krótkie impulsy elektryczne.
Proces ten pozwala kompleksom dostać się do komórki.
sgRNA wiąże się z miejscem docelowym w DNA komórek T, umożliwiając Cas9 edycję DNA, tworząc przerwę w obu niciach.
To zakłócenie sygnalizuje białkom naprawczym dotarcie do tego miejsca.
Białka naprawcze następnie ponownie łączą końce, co sprawia, że gen przestaje działać.
Inkubować limfocyty T z edytowanymi genami w odpowiednim podłożu do dalszych testów.
Przygotować rybonukleoproteinę lub kompleks RNP, inkubując 10 mikrogramów nukleazy Cas9 z 5 mikrogramami pojedynczego prowadzącego RNA przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Dołącz symulowaną kontrolę bez pojedynczego prowadzącego RNA. Połącz zawieszone limfocyty T z kompleksem RNP i dodaj 4,2 mikrolitra 4-mikromolowego wzmacniacza elektroporacji. Dobrze wymieszaj i przenieś do kuwet do elektroporacji.
Galwanizować ogniwa za pomocą kodu impulsu EH-1-11. Następnie inkubuj 5 milionów komórek na mililitr w R-10, uzupełnionych pięcioma nanogramami na mililitr ludzkiej IL-7 i ludzkiej Il-15 w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 48 godzin na 12-dołkowych płytkach. Po inkubacji przystąp do aktywacji i ekspansji limfocytów T.