Generowanie podwójnie humanizowanego modelu myszy BLT (szpik kostny, wątroba, grasica)

Zacznij od znieczulonej myszy z niedoborem odporności, która nie ma komórek odpornościowych.

Potraktuj mysz subśmiertelną dawką promieni rentgenowskich, aby wyeliminować istniejące komórki macierzyste ze szpiku kostnego.

Przeprowadź sekcję myszy i dostarcz fragmenty ludzkiej płodu, wątroby i tkanki grasicy między nerkę a jej torebkę.

Zamknij nacięcie.

Wszczepiona wątroba i tkanka grasicy rosną, tworząc organoidy, które są agregatami komórkowymi przypominającymi narząd.

Po wyzdrowieniu należy wstrzyknąć ludzkie hematopoetyczne komórki macierzyste lub HSC do żyły ogonowej.

Wstrzyknięte HSC migrują do organoidu grasicy i szpiku kostnego, różnicując się w różne ludzkie komórki odpornościowe.

Podaj myszowi wodę uzupełnioną antybiotykami, aby zabić istniejące drobnoustroje jelitowe.

Za pomocą rurki doustnej wprowadź ludzkie drobnoustroje kałowe bezpośrednio do jelita myszy, aby przyspieszyć kolonizację drobnoustrojów.

W ten sposób opracowano podwójnie humanizowany model myszy BLT z ludzkim układem odpornościowym i drobnoustrojami jelitowymi.

Aby wszczepić tkanki wątroby i grasicy do lewej torebki nerkowej, najpierw umieść mysz w kapturze. W dniu zabiegu należy potraktować myszy subletalnym napromienianiem całego ciała w dawce 12 centi-gray na gram masy ciała. Ogol każdą mysz wokół lewej bocznej i przyśrodkowej strony po potwierdzeniu odpowiedniego poziomu sedacji. Nałóż maść okulistyczną na oczy zwierzęcia i w razie potrzeby załóż kolczyk w uchu, a następnie zdezynfekuj skórę trzema sekwencyjnymi peelingami jodowymi i 70% izopropanolowymi.

Po przygotowaniu skóry użyj kleszczy, aby załadować od 1 do 1,6 milimetra sześciennego ludzkiego fragmentu tkanki wątroby płodu do trokaru, a następnie jeden do 1,6 milimetra sześciennego fragmentu ludzkiej tkanki grasicy płodu. Użyj kleszczy, aby podnieść skórę i użyj skalpela, aby wykonać małe podłużne nacięcie w skórze. Przedłuż cięcie do 1,5 do 2 centymetrów po lewej stronie myszy i użyj kleszczy, aby podnieść warstwę mięśni. Za pomocą nożyczek otwórz warstwę mięśniową wzdłużnie, w razie potrzeby przedłużając nacięcie, aby odsłonić nerkę i delikatnie chwycić tkankę tłuszczową otaczającą nerkę.

Za pomocą skalpela wykonaj 1 do 2-milimetrowego nacięcia na tylnym końcu torebki nerkowej i powoli włóż wstępnie załadowany trokar do nacięcia, równolegle do długiej osi nerki. Uwolnij tkanki między torebką nerkową a nerką i przywróć nerkę i jelita do ich normalnych pozycji. Następnie użyj szwów, aby zamknąć warstwę mięśniową i zszywek chirurgicznych, aby zamknąć skórę. Umieść mysz w autoklawowanej klatce z mikroizolatorem z monitorowaniem aż do pełnego zamknięcia. Sześć godzin po zabiegu umieść myszy pod lampą grzewczą i zdezynfekuj je 70% izopropanolem.

Wstrzyknąć 1,5 do 5 x 10⁵ CD34-dodatnich ludzkich płodowych komórek macierzystych w 200 mikrolitrach PBS do jednej rozszerzonej żyły ogonowej na zwierzę. Następnie zatamuj krwawienie delikatnym uciskiem i wróć do domowej klatki. 9 do 12 tygodni po operacji użyj odpowiedniej wielkości plastikowego stożka, aby odizolować jedną nogę jednej humanizowanej myszy i spryskaj przyśrodkową stronę izolowanej nogi 70% izopropanolem. Rozprowadź antybiotyk i maść przeciwbólową na miejscu pobrania.

Za pomocą igły o rozmiarze 25 trzymanej pod kątem 90 stopni nakłuj żyłę odpiszczelową, aby zebrać od 50 do 100 mikrolitrów krwi do probówki do pobrania krwi pokrytej EDTA. Po uzyskaniu odpowiedniej objętości krwi należy przyłożyć do tego miejsca sterylny kawałek gazy, aby zatrzymać krwawienie przed powrotem myszy do klatki. Następnie użyj pobranej próbki krwi obwodowej do oceny poziomu rekonstytucji ludzkich komórek odpornościowych za pomocą cytometrii przepływowej, używając przeciwciał przeciwko ludzkim CD45, CD3, CD4, CD8, CD19 i mysim CD45.

Aby pobrać świeżą próbkę kału, umieść indywidualne autoklawowane worki papierowe w dygestoriach i umieść jedną mysz w każdej torbie, aż każde zwierzę się wypróżni. Następnie wróć myszy do klatki i użyj sterylnych kleszczy, aby przenieść każdą próbkę kału do jednej 1,5-mililitrowej probówki na mysz do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Pod koniec 14-dniowej antybiotykoterapii zmień wodę pitną na sterylizowaną wodę w autoklawie i przenieś myszy do nowej autoklawowanej klatki. 24 i 48 godzin po odstawieniu antybiotyków napełnij odpowiednio przygotowane źródła materiału do przeszczepu mikrobioty kałowej i podwielokrotn próbki w komorze beztlenowej w warunkach beztlenowych.

Aby przeprowadzić przeszczep kału, należy dostarczyć 200 mikrolitrów materiału do przeszczepu mikrobioty kałowej za pomocą zgłębnika doustnego do każdego zwierzęcia doświadczalnego i rozprowadzić pozostały rozmrożony materiał na futrze humanizowanych myszy lub na ściółkę klatki.