JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 wyświetleń • 4:22 min • July 8th, 2025
Weź mieszaninę CRISPR RNA lub crRNA i transaktywującego crRNA lub tracrRNA.
Podgrzej mieszaninę i pozwól jej ostygnąć, ułatwiając parowanie zasad tracrRNA z crRNA w celu utworzenia przewodnika RNA lub gRNA.
Dodaj molekularne nożyczki zwane enzymami Cas9, które wiążą się z gRNA, tworząc kompleksy.
Dodaj kompleksy Cas9-gRNA do komórek Natural Killer lub NK zawieszonych w roztworze do elektroporacji.
Wprowadź jednoniciowe cząsteczki DNA, które pomagają w transporcie kompleksów Cas9-gRNA.
Przenieś mieszaninę do kuwety i wykonaj elektroporację, tworząc tymczasowe pory w błonie, aby kompleksy mogły dostać się do komórki.
gRNA wiąże się z docelowym miejscem w genomie, umożliwiając Cas9 rozszczepienie DNA.
Białka naprawcze wiążą się w miejscu pęknięcia i dołączają do DNA, często powodując błędy insercji lub delecji par zasad. Wynikająca z tego modyfikacja zaburza docelowy gen, czyniąc go niefunkcjonalnym.
Przenieść genetycznie zmodyfikowane komórki do odpowiedniego podłoża w celu dalszej analizy.
W dniu elektroporacji napełnić jedną kolbę T25 8 mililitrami świeżej pożywki hodowlanej uzupełnionej 100 IU na mililitr IL-2 na eksperymentalny stan komórki i umieścić kolby w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 .
Podczas gdy pożywka się równoważy, dodaj 3 do 4 x 106 komórek na warunek, na 26 mikrolitrów transdukcji wymieszaj do stożkowej probówki i osadź komórki przez odwirowanie. Następnie umyj komórki trzy razy w 12 mililitrach sterylnego PBS na pranie, aby usunąć cały FBS z zawiesin komórek.
Podczas mycia komórek należy ponownie zawiesić każdy RNA CRISPR i RNA znacznikowy do końcowych stężeń 200 mikromolowych. Wymieszaj 2,2 mikrolitra każdego RNA CRISPR z jedną 200-mikromolową objętością znacznikowego RNA na próbkę i podgrzewaj próbki w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 5 minut. Następnie pozwól próbkom ostygnąć do temperatury pokojowej i przechowuj kompleksy CRISPR RNA - znacznikowy RNA w temperaturze ujemnych 20 stopni Celsjusza do czasu ich użycia.
Aby utworzyć kompleksy rybonukleoproteinowe, dodaj endonukleazę Cas9 do odpowiedniego odpowiedniego kompleksu CRISPR RNA - znacznikowego RNA z wirowaniem przez 30 do 60 sekund i inkubuj powstałe kompleksy rybonukleoproteinowe Cas9 w temperaturze pokojowej przez 15 do 20 minut.
Po ostatnim płukaniu dodaj całą objętość suplementu do elektroporacji z zestawu Nucleofector roztwór P3 i ponownie zawieś każdą osadkę komórkową w 20 mikrolitrach pierwotnego roztworu P3 4D-Nucleofector, uważając, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.
Natychmiast dodaj 5 mikrolitrów każdego kompleksu rybonukleoproteinowego do odpowiedniej zawiesiny komórkowej i dodaj 1 mikrolitr 100-mikromolowego wzmacniacza elektroporacji Cas9 do mieszanki komórek kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9. Przenieś 26 mikrolitrów roztworu komórek rybonukleoproteinowych Cas9 do indywidualnych dołków paska nukleuwetowego i delikatnie postukaj w pasek, aby upewnić się, że próbki pokrywają dno każdej studzienki.
Następnie uruchom program EN-138 systemu 4D-Nucleofector . Pod koniec transdukcji pozwól komórkom odpocząć przez trzy minuty. Następnie dodaj 80 mikrolitrów wstępnie zbilansowanej pożywki hodowlanej do każdej kuwety i delikatnie przenieś próbki do jednej kolby na warunki w inkubacji 37 stopni Celsjusza.