JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 4:22 min. • July 8th, 2025
Weź mieszaninę CRISPR RNA lub crRNA i transaktywującego crRNA lub tracrRNA.
Podgrzej mieszaninę i pozwól jej ostygnąć, ułatwiając parowanie zasad tracrRNA z crRNA w celu utworzenia przewodnika RNA lub gRNA.
Dodaj molekularne nożyczki zwane enzymami Cas9, które wiążą się z gRNA, tworząc kompleksy.
Dodaj kompleksy Cas9-gRNA do komórek Natural Killer lub NK zawieszonych w roztworze do elektroporacji.
Wprowadź jednoniciowe cząsteczki DNA, które pomagają w transporcie kompleksów Cas9-gRNA.
Przenieś mieszaninę do kuwety i wykonaj elektroporację, tworząc tymczasowe pory w błonie, aby kompleksy mogły dostać się do komórki.
gRNA wiąże się z docelowym miejscem w genomie, umożliwiając Cas9 rozszczepienie DNA.
Białka naprawcze wiążą się w miejscu pęknięcia i dołączają do DNA, często powodując błędy insercji lub delecji par zasad. Wynikająca z tego modyfikacja zaburza docelowy gen, czyniąc go niefunkcjonalnym.
Przenieść genetycznie zmodyfikowane komórki do odpowiedniego podłoża w celu dalszej analizy.
W dniu elektroporacji napełnić jedną kolbę T25 8 mililitrami świeżej pożywki hodowlanej uzupełnionej 100 IU na mililitr IL-2 na eksperymentalny stan komórki i umieścić kolby w nawilżonym inkubator
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych