JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 wyświetleń • 2:58 min • July 8th, 2025
Zacznij od dwukierunkowych plazmidów przenoszących cDNA kodujących pewne niezbędne białka wirusa szczepu grypy przystosowanego do przeziębienia.
Wprowadzenie nowego zestawu dwukierunkowych plazmidów zawierających hemaglutyninę i zmodyfikowane cDNA neuraminidazy z innego szczepu grypy.
Wprowadzić odczynnik do transfekcji do tej mieszaniny i inkubować, aby utworzyć kompleks z plazmidami.
Przenieś te kompleksy na hodowane ludzkie komórki podobne do nabłonka, aby umożliwić wejście plazmidu do komórki.
Dwukierunkowe plazmidy z dwoma promotorami w przeciwnych orientacjach umożliwiają produkcję białek wirusowych i odpowiadającego im RNA.
Inkubować komórki w niższej temperaturze.
Białka wirusowe i wirusowe RNA samoorganizują się, tworząc rekombinowane wirusy grypy przystosowane do zimna o zmniejszonej replikacji w cieplejszych warunkach.
Nakładka z komórkami MDCK z nadekspresją kwasu sjalowego i zmodyfikowanymi enzymami trypsyny, które umożliwiają przyczepianie się wirusa i wnikanie do wnętrza komórek.
Inkubować w tej samej temperaturze w celu wywołania replikacji i produkcji nowych wirusów.
Odwirować i zebrać rekombinowane żywe atenuowane wirusy grypy gotowe do przygotowania szczepionki.
Na początek umieść milion komórek 293T w każdym dołku 6-dołkowej płytki z DMEM zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% paciorkowca. Następnie przygotuj wystarczającą ilość mieszaniny transfekcji plazmidu na 100 mikrolitrów na studzienkę. Połącz mikrogram każdego plazmidu i napełnij probówkę wstępnie podgrzanym podłożem komórkowym Opti-MEM do 50 mikrolitrów. W innej probówce dodaj dwukrotność objętości lipofektaminy 2000 odpowiadającej całkowitej ilości plazmidu do transfekcji i uzupełnij probówkę do 50 mikrolitrów Opti-MEM.
Przed dodaniem mieszanki transfekcyjnej do komórek pozostaw ją na 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 100 mikrolitrów mieszanki transfekcyjnej do każdej studzienki i przenieś płytkę do inkubatora na 16 godzin. Następnego dnia zmień pożywkę na DMEM z 0,3% BSA i 1% paciorkowcem. Wtedy. przenieś komórki do 33 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla na pięć godzin.
Po pięciu godzinach dodaj nakładkę miliona komórek MDCK przepuszczających grypę w DMEM uzupełnionym trypsyną. Utrzymuj kokultury przez 2 do 3 dni w reżimie inkubacji w 33 stopniach Celsjusza, aby wytworzyć i amplifikować wirusa. Później usuń zanieczyszczenia za pomocą pięciominutowego wirowania o wadze 260 g, a następnie zbierz supernatanty.