Test in vitro do oceny cytotoksyczności komórek NK wobec komórek rakowych

Weź płytkę wielodołkową zawierającą komórki NK i komórki rakowe. Studzienki kontrolne zawierają tylko komórki rakowe.

Wirówka, aby ułatwić kontakt komórkowy.

Inkubować. Aktywacja receptorów na komórkach NK wiąże się z ligandami powierzchniowymi komórek rakowych, pobudzając komórki NK do uwalniania granulek zawierających cząsteczki cytotoksyczne.

Cząsteczki te tworzą pory błony komórkowej raka i indukują apoptozę, uwalniając zawartość wewnątrzkomórkową, w tym dehydrogenazę mleczanową lub LDH.

Dodaj detergent, aby zmylić komórki rakowe w studzienkach kontrolnych w celu maksymalnego uwolnienia LDH.

Odwirować i przenieść część supernatantów zawierających LDH na płytkę testową.

Dodać odczynnik do oznaczania i inkubować.

LDH przekształca mleczan w pirogronian redukujący NAD+. Diaphorase wykorzystuje NADH do redukcji soli tetrazoliowej, tworząc czerwony produkt formazanu.

Dodaj kwaśny roztwór, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną.

Za pomocą czytnika mikropłytek zmierzyć absorbancję formazanu w studzienkach.

Intensywność formazanu jest proporcjonalna do liczby komórek nowotworowych poddanych lizie w badanym dołku, co wskazuje na cytotoksyczność komórek NK wobec komórek nowotworowych.

Najpierw należy zaopatrzyć się w 96-dołkową płytkę z kulturą okrągłodenną i ustawić ją zgodnie z opisem w tabeli 1 protokołu tekstowego. Odwirować płytkę testową pod ciśnieniem 250 razy g przez 4 minuty, aby upewnić się, że efektor i komórki docelowe są w kontakcie. Następnie inkubuj płytkę w wilgotnej komorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 5 godzin.

Na 45 minut przed zbiorem supernatantów dodać 10 mikrolitrów 10-krotnego roztworu do lizy do studzienek o maksymalnym uwalnianiu LDH w komórce docelowej i umieścić płytkę z powrotem w wilgotnej komorze. Po zakończeniu inkubacji odwirować płytkę z ciśnieniem 250 razy g przez 4 minuty. Następnie za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 50-mikrolitrowe porcje z każdej studzienki na świeżą 96-dołkową płaską płytkę testową.

Dodać 50 mikrolitrów odczynnika do oznaczania do każdego dołka płytki testowej. Przykryj płytkę folią, aby chronić ją przed światłem i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie dodaj 50 mikrolitrów roztworu zatrzymującego do każdej studzienki. Upewnij się, że odczytałeś płytkę w ciągu 1 godziny od dodania roztworu zatrzymującego i zapisz absorbancję na poziomie 490 nanometrów.