JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 3:32 min. • July 8th, 2025
Weź płytkę mikrodołkową pokrytą rekombinowanymi fragmentami fibronektyny i dodaj aktywowane mysie limfocyty T CD8-dodatnie.
Wprowadź wektory retrowirusowe zawierające transgeniczne RNA, które koduje chimeryczny receptor antygenowy lub CAR.
Przykryj płytkę i zamknij ją w torbie, aby uniknąć zanieczyszczenia. Odwirować płytkę z niską prędkością, aby ułatwić interakcję wirus-komórka.
Fibronektyna wiąże się z wirusem i komórką, kolokalizując je w celu zwiększenia transferu genów za pośrednictwem wirusa.
Po odwirowaniu wyjąć szczelnie zamknięty worek i inkubować płytkę w warunkach fizjologicznych.
Otoczka wektora wirusowego łączy się z błoną komórkową, uwalniając wirusowe RNA i enzymy.
Enzymy wirusowe dokonują odwrotnej transkrypcji uwolnionego RNA i integrują powstałe DNA z genomem gospodarza, umożliwiając komórkom ekspresję CAR związanych z powierzchnią.
CAR składa się z domeny wiążącej antygen specyficznej dla antygenu docelowego i domen sygnalizacyjnych do aktywacji limfocytów T.
Limfocyty CAR T specyficzne dla antygenu są gotowe do dalszych testów.
W pierwszym dniu przygotuj płytki pokryte ludzkim fragmentem fibronektyny, dodając 0,5 mililitra fibronektyny do dołków 24-dołkowej płytki i inkubując ją przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Następnego dnia usuń roztwór fibronektyny i dodaj 1 mililitr 2% BSA w PBS na studzienkę. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut i umyć poddane działaniu środka studzienki 1 mililitrem sterylnego PBS. Płytka jest gotowa do użycia po usunięciu roztworu myjącego.
Policz aktywowane limfocyty T CD8 za pomocą błękitu trypanowego. Zbierz je przez wirowanie i ponownie zawieś w 5 milionach żywych komórek na mililitr w celu transdukcji. Dodaj 100 mikrolitrów aktywowanej zawiesiny komórek CD8 do każdego dołka płytki pokrytej fibronektyną. Następnie dodaj 1,5 do 2 mililitrów wcześniej przygotowanej pożywki zawierającej wirusa i wymieszaj ruchem wirowym, aby równomiernie dozować komórki.
Zamknij płytkę w torebce z zamkiem błyskawicznym i odwiruj ją w temperaturze 2000 razy g przez 90 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wyjmij płytkę z wirówki i przenieś ją do komory bezpieczeństwa biologicznego. Ostrożnie wyjmij plastikową torbę i upewnij się, że zewnętrzna strona płytki nie jest zanieczyszczona podłożem. Przenieś płytkę do inkubatora dwutlenku węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Po 4 godzinach usuń 1 mililitr pożywki z każdej studzienki. Zastąp go 1 mililitrem wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki z komórek T i umieść płytkę z powrotem w inkubatorze.