Budowa humanizowanego modelu myszy z inżynieryjną odpornością na HIV

Przygotuj znieczuloną mysz biorcę z poważnie obniżoną odpornością.

Wykonaj nacięcie, aby odsłonić nerkę i utwórz otwór w torebce nerkowej.

Weźmy igłę do implantu zawierającą ludzką tkankę grasicy płodu i komórki pochodzące z wątroby płodu zawieszone w galaretowatej mieszaninie białek.

Komórki te zawierają zmodyfikowane hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC), wyrażające chimeryczne receptory antygenowe (CAR), skierowane przeciwko wirusowi HIV.

Wszczepić zawiesinę komórkową i tkankę grasicy pod torebkę, a następnie zamknąć nacięcie.

Następnie wstrzyknij retroorbitalnie HSC wykazujące ekspresję CAR i pozwól myszy dojść do siebie.

W nerce galaretowata mieszanina białek polimeryzuje w matrycę, zatrzymując HSC w miejscu implantacji.

Macierz HSC migruje do grasicy, różnicując się w funkcjonalne ludzkie limfocyty T.

Tymczasem wstrzyknięte po orbicie HSC docierają do szpiku kostnego i różnicują się w funkcjonalne ludzkie limfocyty B, monocyty i komórki NK.

Model myszy z ludzkim układem odpornościowym przeciwko wirusowi HIV jest już gotowy.

Wlej kawałki grasicy i podłoże z kolby do 60-milimetrowego naczynia. Schłodź niektóre końcówki do pipet wyporowych, umieszczając je w otwartych sterylnych probówkach z 1,5-mililitrową nakrętką na lodzie. Umieść również granulki komórek i objętość galaretowatej mieszanki białek, takiej jak Matrigel, na lodzie.

Znieczulić myszy biorcę środkiem znieczulającym do wstrzykiwań zgodnie z zatwierdzonym protokołem dla zwierząt. Sprawdź poziom znieczulenia myszy, ściskając łapę. Brak reakcji na uszczypnięcie wskazuje na chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia.

Ogol lewą stronę każdej myszy od biodra do ramienia, między środkiem pleców a brzuchem. Podskórnie wstrzyknąć 6 miligramów na kilogram rozcieńczonego karprofenu w ramię lub trójkąt pachwinowy zwierzęcia. Przepłucz kaniulę trokaru za pomocą PBS w 60-milimetrowym naczyniu. Za pomocą, zakrzywionych kleszczy umieść kawałek grasicy z 60-milimetrowej szalki tuż w otworze kaniuli, a następnie pociągnij do tyłu trokar, aby zassać tkankę do kaniuli.

Następnie użyj pipety wyporowej i schłodzonej końcówki, aby dodać 5 mikrolitrów zimnej galaretowatej mieszanki białek do probówki z osadem komórkowym i delikatnie wymieszaj, aby wytworzyć zawiesinę komórek. Odpipetować zawiesinę komórek do otworu kaniuli i powoli pociągnąć za trokar, aby załadować igłę.

Przetrzyj ogolony obszar myszy jodonem powidonu, a następnie trzykrotnie izopropanolem. Określ najciemniejsze miejsce pod skórą, które wskazuje lokalizację śledziony. Nerka znajduje się około 5 milimetrów grzbietowo do śledziony.

Po zapewnieniu odpowiedniego poziomu znieczulenia przy braku reakcji na uszczypnięcie łapy, użyj zakrzywionych kleszczy, aby podnieść skórę i użyj nożyczek chirurgicznych, aby wykonać 15-milimetrowe nacięcie w skórze równolegle do śledziony. Następnie wykonaj podobne nacięcie w warstwie otrzewnej poniżej.

U mężczyzn nerka jest łatwo widoczna, a więc wytłaczana po prostu przez naciśnięcie na brzuch. Podeprzyj nerkę hemostatem lub parą zakrzywionych kleszczy. U kobiet jajniki mają tendencję do blokowania nerki przed łatwym usunięciem. Za pomocą hemostatu podnieś jajnik i ostrożnie odsłoń nerkę.

Użyj kleszczyków zakończonych igłą, aby wyrwać mały otwór na tylnym końcu torebki nerkowej. Wsuń trokar do tego otworu i wzdłuż nerki, aż otwór kaniuli zostanie całkowicie zakryty przez torebkę nerkową. Delikatnie wyciśnij tkankę pod torebkę nerkową i wyciągnij trokar z powrotem. Użyj zakrzywionych kleszczy, aby upewnić się, że kawałek grasicy nie wychodzi z igłą.

Następnie podnieś otrzewną za pomocą kleszczy i delikatnie użyj hemostatu, aby wepchnąć nerkę z powrotem na miejsce. Zawiąż jeden podwójnie zawiązany ścieg ze szwem chirurgicznym w otrzewnej. Umieść również dwa klipsy z automatycznymi klipsami, aby zamknąć skórę.

Teraz wymieszaj transdukowane komórki CD34-dodatnie i odessaj 0,5 x 10⁶ komórek w objętości 100 mikrolitrów do strzykawki insulinowej. Wstrzyknij te komórki myszy poprzez wstrzyknięcie żyły zaoczodołowej.

Po wstrzyknięciu należy nanieść niewielką kroplę smaru do oczu na każde oko i położyć mysz na boku z powrotem w klatce. Po wszczepieniu implantów wszystkim myszom upewnij się, że zwierzęta odzyskały przytomność i są w stanie chodzić przed powrotem do pomieszczenia socjalnego.