$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Zacznij od hodowli komórek macierzystych szpiku kostnego.
Wprowadź bufor trypsyna-EDTA, aby odłączyć komórki i rozbić grudki komórek, tworząc zawiesinę jednokomórkową.
Odwirować, a następnie usunąć supernatant. Zawiesić osad świeżym podłożem.
Przenieść zawiesinę do strzykawki i podłączyć ją do zespołu filtrującego membranowego.
Nacisnąć tłok i wyrzucić pożywkę zawierającą filtrat.
Odłącz filtr. Napełnić strzykawkę świeżym podłożem. Ponownie podłącz filtr i szybko popchnij tłok.
Ciśnienie cieczy zmusza komórkę do zmierzania w kierunku porów filtra.
W ten sposób powstaje kulisty pęcherzyk błony plazmatycznej lub PMV.
Pęcherzyki te zawierają składniki komórkowe i organelle otoczone błoną.
Zbadaj filtrat pod mikroskopem z odwróconym kontrastem fazowym, aby zaobserwować półprzezroczyste kuliste pęcherzyki.
Wymiary pęcherzyków zgadzają się z wielkością porów membrany filtracyjnej, co potwierdza wytwarzanie PMV.
Aby wytworzyć PMV, najpierw należy wyhodować mysie PMSC w kompletnej pożywce hodowlanej DMEM w jednym dołku sześciodołkowej płytki w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Gdy komórki osiągną 90% konfluencji, przepłucz studzienkę 0,5 mililitra bezwapniowego PBS i odłącz komórki 0,5 mililitra 0,25% trypsyny-EDTA.
Po trzech minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza postukaj kilka razy w płytkę dłonią, aby ułatwić dysocjację komórek i zatrzymać trawienie za pomocą 1 mililitra pożywki hodowlanej. Przenieś komórki do 5-mililitrowej stożkowej probówki do odwirowania i ponownie zawieś osad w 4 mililitrach świeżej pożywki hodowlanej. Następnie podziel komórki między dwie studzienki nowej sześciodołkowej płytki i włóż płytkę z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych na 24 godziny.
Następnego dnia zbierz komórki z jednej studzienki przez trawienie trypsyną, jak właśnie pokazano, ponownie zawieszając osad w 0,5 mililitra świeżej pożywki hodowlanej po zebraniu przez odwirowanie. Załaduj komórki do 1-mililitrowej strzykawki insulinowej i podłącz strzykawkę do jednostki filtrującej. Szybko wciśnij tłok, aby przecisnąć komórki przez filtr i wyrzucić wytłaczane medium. Następnie załaduj i dozuj 0,5 mililitra dodatkowej pożywki hodowlanej przez filtr, jak właśnie pokazano, zbierając pożywkę z drugiego wytłaczania.
Wysiewaj 150 mikrolitrów zebranego podłoża do 35-mililitrowego naczynia ze szklanym dnem i pozwól pęcherzykom osiąść przez około 10 minut. Następnie potwierdź obecność PMV pod mikroskopem z odwróconym kontrastem fazowym wyposażonym w kamerę CCD z 20-krotną soczewką obiektywową.