JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 5:34 min. • July 8th, 2025
Zacznij od rurki ustnej zawierającej zawiesinę genetycznie przekształconych, auksotroficznych drożdży, które nie są w stanie wytworzyć uracylozasady nukleotydowej.
Włóż rurkę ustną do ust skrępowanej myszy i poprowadź ją w dół do żołądka.
Zawiesinę drożdży należy podawać bezpośrednio do żołądka, dzięki czemu ostatecznie dotrze ona do jelita cienkiego.
Jelito cienkie zawiera komórki nabłonkowe, a leżące pod nim plamy Peyera są bogate w komórki odpornościowe.
Komórki mikrofałdowania, wyspecjalizowane komórki nabłonka jelitowego w pobliżu łat Peyera, pochłaniają komórki drożdży i internalizują je w pęcherzyki.
Pęcherzyki te przemieszczają się po komórkach i uwalniają komórki drożdży do leżącego pod spodem plastra Peyera.
Wyizoluj plaster Peyera z poświęconego jelita myszy i uzyskaj jednolitą zawiesinę komórkową.
Hodować tę zawiesinę komórkową na pożywce selektywnej dla drożdży zawierającej uracyl.
Drożdże auksotroficzne wykorzystują uracyl i namnażają się, tworząc kolonie, potwierdzając dostarczanie przekształconych komórek drożdży do jelitowego układu odpornościowego myszy.
Po przygotowaniu kultur drożdży zgodnie z protokołem tekstowym użyj hemocytometru, aby określić stężenie komórek i dostosuj do 10 do dziewiątych komórek na mililitr. Granulować komórki przez odwirowanie 2,500 razy g przez trzy minuty. Następnie odlać supernatant i ponownie zawiesić komórki, dodając odpowiednią ilość sterylnej wody i delikatnie pipetując w górę iw dół.
Przymocuj odpowiednią igłę do zgłębnika na sterylnej strzykawce o pojemności 1 mililitra i załaduj próbkę drożdży, eliminując wszelkie pęcherzyki powietrza. Załaduj dodatkową strzykawkę sterylną wodą, aby kontrolować zgłębniki. Używając ręki niedominującej, podnieś mysz, którą chcesz nakłuć, a następnie palcem wskazującym i kciukiem mocno chwyć skórę wokół szyi. Wsuń ogon pod mały palec. Upewnij się, że uchwyt jest bezpieczny i uniemożliwia myszowi poruszanie głową.
Następnie delikatnie włóż igłębkę do przełyku myszy, kierując igłę wzdłuż podniebienia i tylnej części gardła, trzymając się nieco na lewo od środka. Poczekaj, aż mysz połknie gruszkę igły. Jeśli czujesz opór lub mysz sapie, delikatnie wyjmij igłę i spróbuj ponownie znaleźć przełyk.
Po tym, jak mysz połknie gruszkę igły z zgłębkiem, delikatnie naciśnij tłok strzykawki, aby podać drożdże bezpośrednio do żołądka myszy. Delikatnie wyjmij igłębkę z żołądka i przełyku myszy i włóż mysz z powrotem do klatki. Sprawdź, czy mysz oddycha i porusza się normalnie, aby upewnić się, że zgłębnik został wykonany prawidłowo.
Po poświęceniu myszy zgodnie z protokołem tekstowym, ustaw ją tak, aby brzuch był całkowicie odsłonięty i użyj 70% etanolu do spryskania okolicy brzucha. Nożyczkami wykonaj poprzeczne nacięcie przez futro i skórę. Następnie ręcznie podważ nacięcie, aby jeszcze bardziej odsłonić otrzewną, cienką błonę surowiczą, która pokrywa narządy jamy brzusznej. Delikatnie unieś otrzewną i wykonaj poprzeczne nacięcie, aby odsłonić jelita.
Następnie użyj kleszczy, aby ostrożnie odsunąć jelito cienkie od tętnic krezkowych, tłuszczu i innych tkanek. Odsłoń jelito cienkie z żołądka w lewym górnym kwadrancie brzucha myszy do jelita ślepego, dużej kieszonki tkanki jelitowej na początku jelita grubego.
Następnie wyizoluj łaty Peyera, szukając od 1 do 2 milimetrów, z grubsza okrągłych plam nieprzezroczystej tkanki wzdłuż jelita cienkiego. Następnie, za pomocą zakrzywionych nożyczek preparacyjnych, odetnij kopułę łaty Peyera, pozostawiając marginesy, aby upewnić się, że żadna z otaczających tkanek nie zostanie zebrana.
Przenieś wypreparowane plastry Peyera do kompletnego IMDM. Następnie wlej roztwór z zawieszonymi plastrami Peyera na sitko o średnicy 40 mikrometrów. Po umyciu plastrów Peyera pełnym IMDM, użyj tłoka z 1-mililitrowej strzykawki, aby delikatnie rozbić tkankę i zebrać komórki w 50-mililitrowej tubce. Granuluj napięte komórki z prędkością 1,800 obr./min przez siedem minut. Następnie poczekaj i przeanalizuj komórki zgodnie z protokołem tekstowym.