JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 wyświetleń • 4:21 min • July 8th, 2025
Weźmy mysi nowotwór czerniaka składający się z neutrofili związanych z nowotworem lub TAN.
TAN wykazują podwyższoną aktywność enzymu fosforybozylotransferazy nikotynamidu lub NAMPT, stymulując angiogenezę, proliferację naczyń krwionośnych w guzach i ułatwiając wzrost guza.
Zmiel tkankę i dodaj enzymy, aby zdegradować macierz tkankową, rozluźniając komórki.
Przefiltruj zawiesinę przez sitko i odwiruj, aby osadzać komórki.
Dodać bufor do lizy, aby zmylić czerwone krwinki, a następnie odwirować i wyrzucić supernatant zawierający resztki komórek.
Wprowadź przeciwciała, aby zablokować komórkowe receptory Fc, unikając w ten sposób nieswoistego barwienia immunologicznego.
Wprowadź znakowany fluoroforem koktajl przeciwciał specyficzny dla markerów powierzchniowych na tanach i barwnika w celu rozróżnienia martwych komórek.
Za pomocą FACS wyizoluj znakowane fluoroforem żywotne TAN i przenieś je na mikropłytkę.
Dodać inhibitor blokujący aktywność NAMPT do wybranych studzienek i inkubować.
Użyj komórek, aby ocenić ich zdolność do stymulacji angiogenezy. Tany leczone inhibitorami wykazują zmniejszoną angiogenezę w porównaniu z nieleczonymi TAN.
W celu izolacji neutrofili związanych z nowotworem, umieść pięć guzów na studzienkę w pojedynczych dołkach sterylnej sześciodołkowej płytki, podczas ich zbierania, i użyj sterylnych nożyczek, aby zmielić guzy na 2 do 3 milimetrowych kawałków. Następnie trawić fragmenty guza za pomocą 1 mililitra kolagenazy na bazie dysku, roztworu DNazy I przez 45 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla z wilgotnością, mieszając próbki za pomocą 10-mililitrowej strzykawki co 15 minut.
Pod koniec inkubacji przefiltruj komórki przez sitka o średnicy 100 mikrometrów do jednej 15-mililitrowej probówki na studzienkę, aby usunąć niestrawione włókna, i dodaj PBS do końcowej objętości 15 mililitrów. Zebrać zdysocjowane komórki przez odwirowanie i poddać lizie czerwone krwinki za pomocą 1 mililitra buforu do lizy na probówkę.
Po wymieszaniu połącz zawartość z każdej probówki w jedną 15-mililitrową probówkę, zatrzymując reakcję po dwóch minutach za pomocą 11 mililitrów kompletnego podłoża o temperaturze 4 stopni Celsjusza. Po odwirowaniu ponownie zawieś osad w 1 mililitrze PBBS i zablokuj wszelkie niespecyficzne wiązania trzema mikrolitrami przeciwciała zablokowanego FC na 15 minut na lodzie.
Pod koniec inkubacji oznacz komórki przeciwciałami anty-CD11b i Ly6G oraz wszelkimi innymi interesującymi przeciwciałami oraz DAPI na 30-minutową inkubację na lodzie chronionym przed światłem. Pod koniec inkubacji umyj komórki w 14 mililitrach PBS i ponownie zawieś granulki w tempie 1 x 107 komórek na mililitr świeżej pełnej pożywki o stężeniu na lodzie.
Następnie posortuj CD11b-dodatnie neutrofile Ly6G-ujemne DAPI na aktywowanym fluorescencyjnie sortowniku komórek zgodnie ze standardowymi protokołami sortowania, sprawdzając czystość wyizolowanych neutrofili na cytometrze przepływowym na końcu sortowania. W przypadku inhibicji neutrofili związanych z nowotworem in vitro, należy zasiać 1,5 razy 10 do piątego posortowanego neutrofila do każdego z dwóch dołków 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U i dodać FK866 do końcowego stężenia 100 nanomolów w kompletnej pożywce do jednego dołka i równą objętość samego kompletnego podłoża do drugiego dołka. Po dwóch godzinach w inkubatorze do hodowli komórkowych należy dwukrotnie przemyć komórki PBS i ponownie zawiesić granulki w PBS w odpowiednim stężeniu do następnego wstrzyknięcia.