JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 wyświetleń • 3:12 min • July 8th, 2025
Rozpocząć od zawiesiny Mycobacterium bovis BCG, potraktowanej niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym, aby zapobiec zbrylaniu się bakterii.
Następnie dodaj odczynnik do biotynylacji i inkubuj.
Ten odczynnik biotynylacyjny, kompleks biotyny skompleksowany w funkcjonalny łącznik, ułatwia wiązanie cząsteczek biotyny z białkami powierzchniowymi bakterii, znakując bakterie.
Po inkubacji odwirować zawiesinę bakteryjną znakowaną biotyną, aby usunąć nieprzereagowany odczynnik biotynylacyjny.
Ponownie zawiesić bakterie w buforze. Dodać roztwór białka fuzyjnego awidyny, rekombinowanego białka składającego się z docelowej domeny antygenowej połączonej z monomeryczną awidyną.
Podczas inkubacji awidyna wiąże się z biotyną, ułatwiając modyfikację powierzchni bakterii za pomocą docelowych antygenów.
Odwirować zawiesinę w celu usunięcia niezwiązanych białek fuzyjnych.
Ponownie zawiesić bakterie pokryte antygenem w buforze zawierającym niejonowy środek powierzchniowo czynny. Powłoka antygenowa na bakterii może wzmocnić jej właściwości w celu wywołania odpowiedzi immunologicznej.
Pracuj w komorze bezpieczeństwa biologicznego przy użyciu środków ochrony osobistej, ponieważ BCG jest patogenem II poziomu.
Aby biotynylować powierzchnię komórek BCG, najpierw hoduj komórki na platformie wytrząsającej do odpowiedniej gęstości. Zbierz około 1 miliarda komórek i umyj je trzykrotnie za pomocą 500 mikrolitrów lodowatego PBST wolnego od endotoksyn. Następnie odwiruj komórki i zawieś je w sterylnym, wolnym od endotoksyn PBS. Następnie przygotuj świeżą 10-milimolową biotynę Sulfo-NHS SS w sterylnej przefiltrowanej wodzie. Następnie inkubuj bakterie w 1 mililitrze bulionu zawierającym 0,5 milimola biotyny Sulfo-NHS SS. Inkubację w temperaturze pokojowej należy wykonywać przez 30 minut.
Następnie umyj teraz oznaczone bakterie trzykrotnie 500 mikrolitrami lodowatego PBST, aby usunąć nieprzereagowany odczynnik. Następnie ponownie zawieś granulki w 1 mililitrze PBST.
Wymieszaj 500 milionów biotynylowanych BCG z białkiem fuzyjnym awidyny, aby uzyskać końcowe stężenie 10 mikrogramów białka na mililitr. Pozwól tej reakcji trwać przez godzinę w temperaturze pokojowej na shakerze. Następnie umyj bakterie trzykrotnie 500 mikrolitrami lodowatego PBST.