Technika hodowli neuronów hipokampa myszy

Weźmy upolowane młode mysie hipokamp w buforze.

Pokrój hipokamp na mniejsze fragmenty i przenieś je do stożkowej rurki.

Umyj chusteczkę buforem. Gdy fragmenty osiądą, usuń bufor. Teraz dodaj świeży bufor i trypsynę.

Podczas inkubacji trypsyna, enzym proteolityczny, trawi macierz zewnątrzkomórkową tkanki, rozluźniając neurony hipokampa.

Przetrawioną tkankę przepłukać buforem.

Gdy fragmenty osiądą, usuń bufor. Dodać świeży bufor i kilkakrotnie pipetować tkankę, aby mechanicznie ją zdysocjować, uzyskując zawiesinę jednokomórkową.

Gdy niestrawiona tkanka opadnie, przenieś zawiesinę komórkową na szkiełka nakrywkowe pokryte poli-L-lizyną z podporami woskowymi na płytce hodowlanej zawierającej pożywkę.

Ogniwa przyczepiają się do powierzchni pokrytych poli-L-lizyną poprzez oddziaływania elektrostatyczne.

Teraz umieść szkiełka nakrywkowe przylegające do neuronów skierowane w dół do naczynia zawierającego komórki glejowe korowe lub nieneuronalne w pożywce wolnej od surowicy.

W hodowli podpory woskowe zapobiegają bezpośredniemu kontaktowi między neuronami a komórkami glejowymi, tworząc mikrośrodowisko, w którym czynniki wydzielane przez komórki glejowe sprzyjają przetrwaniu i dojrzewaniu neuronów.

Na początek przeanalizuj od sześciu do ośmiu hipokampów od poporodowych, jednodniowych szczeniąt za pomocą pożywki HBSS na szalce Petriego. Pokrój hipokampy nożyczkami preparacyjnymi na mniejsze kawałki i przenieś je z naczynia do 15-mililitrowej tubki. Umyj hipokampy dwukrotnie 5 mililitrami HBSS i pozostaw je w 4,5 mililitrach HBSS po umyciu.

Dodaj 0,5 mililitra 2,5% trypsyny do 4,5 mililitra HBSS i inkubuj w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut, odwracając probówkę co 5 minut. Dobrze strawione hipokampy powinny stać się lepkie i tworzyć skupisko. W razie potrzeby przedłuż trawienie o kolejne 5 minut.

Umyj hipokampy HBSS trzy razy po 5 minut na pranie. Po umyciu dodaj 2 mililitry HBSS i odpipetuj hipokampy w górę iw dół pipetą Pasteura 15 razy. Rozetrzeć tkankę wypolerowaną pipetą Pasteura 10 razy i odstawić probówkę na pięć minut, aż wszystkie kawałki opadną na dno. Powtarzaj rozcieranie z pozostałymi kawałkami, aż większość z nich zniknie.

Następnie użyj 1-mililitrowej końcówki pipety, aby delikatnie przenieść supernatant zawierający zdysocjowane neurony do naczyń galwanicznych. Dodaj go bezpośrednio do wstępnie inkubowanego podłoża galwanicznego i delikatnie potrząśnij płytką. 2 do 4 godzin po wysianiu sprawdź naczynia do powlekania pod mikroskopem świetlnym. Większość neuronów powinna była przyczepić się do szkiełka nakrywkowego.

Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką odwróć szkiełka nakrywkowe do naczyń do karmienia komórek glejowych zawierających wstępnie kondycjonowaną pożywkę do hodowli neuronów, stroną z kropkami woskowymi skierowaną w dół. Neurony mogą rosnąć w naczyniach zasilających komórki glejowe przez okres do jednego miesiąca. Karm neurony co siedem dni 1 mililitrem świeżej pożywki do hodowli neuronów.