Generowanie hodowli neuronów pierwotnych o niskiej gęstości z zamrożonych neuronów embrionalnych

Zacznij od kriowialnego pojemnika zawierającego kriokonserwowane neurony embrionalne i umieść go w bloku grzewczym w celu kontrolowanego rozmrażania.

Następnie przenieś rozmrożone neurony do rurki i rozcieńcz je kroplami pożywką neuropodstawną, aby zrównoważyć ciśnienie osmotyczne i zapobiec lizie komórek.

W ten sposób powstaje jednorodna zawiesina z równomiernie rozproszonymi neuronami.

Rozcieńczoną zawiesinę nerwową należy umieścić na wielodołkowej płytce pokrytej poli-L-lizyną, zawierającej podłoże neurobazalne wzbogacone w składniki odżywcze i antybiotyki.

Inkubuj, aby dodatnio naładowana poli-L-lizyna mogła oddziaływać z neuronami poprzez interakcje elektrostatyczne, ułatwiając ich przyleganie.

Zaopatrz studzienki w świeże podłoża neuropodstawne.

Inkubować komórki w tym samym podłożu w wilgotnych warunkach, aby zapobiec parowaniu pożywki.

Neurony embrionalne wykorzystują składniki odżywcze i rosną poprzez rozwijanie procesów neuronalnych i tworzenie neuronów pierwotnych.

Pożywka neuropodstawowa utrzymuje pierwotne neurony, które wydają się szeroko rozstawione, generując pierwotną kulturę o niskiej gęstości z połączeniami neuronalnymi.

Zacznij od pokrycia 96-dołkowej mikropłytki 100 mikrolitrami poli-L-lizyny na studzienkę. Następnie inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji usunąć roztwór poli-L-lizyny. Umyj płytki dwukrotnie wysterylizowaną wodą i raz świeżą pożywką hodowlaną bez suplementów. Umieść talerze do wyschnięcia. Suche talerze można owijać i przechowywać do miesiąca w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Aby rozpocząć wysiew komórek, dodaj 50 mikrolitrów pożywki hodowlanej do każdego dołka na powlekanej płytce. Napełnij studzienki obwodowe 200 mikrolitrami wysterylizowanej wody i inkubuj płytkę przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.

Wyjmij kriowial neuronu ze zbiornika ciekłego azotu i umieść go w bloku grzewczym o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby częściowo rozmrozić jego zawartość. Za pomocą pipety o pojemności 1 mililitra z końcówką o szerokim otworze powoli przenieś zawartość fiolki kroplami do sterylnej probówki o pojemności 50 mililitrów. Przepłukać pusty kriowial 1 mililitrem pożywki hodowlanej o temperaturze pokojowej. Przenieść roztwór płuczący do 50-mililitrowej probówki zawierającej zawiesinę komórek.

Następnie dodaj kroplami 9 mililitrów pożywki hodowlanej o temperaturze pokojowej do 50-mililitrowej probówki, zwiększając objętość do 11 mililitrów. Po zliczeniu komórek za pomocą hemocytometru przenieś zawiesinę komórek do zbiornika. Teraz, za pomocą pipety wielokanałowej z końcówkami o szerokim otworze, dozuj zawiesinę komórek z końcową liczbą^1,0 x 10 4 komórek na dołek do powlekanej płytki 96-dołkowej.

Inkubuj neurony przez 1 do 2 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% dwutlenkiem węgla. Następnie zastąp pożywkę hodowlaną 100 mikrolitrami podgrzanej pożywki hodowlanej i ponownie inkubuj w tych samych warunkach.