Hodowla fluorescencyjnych neuronów pobudzających z transgenicznego mózgu szczeniaka myszy

Weźmy mózg szczeniaka transgenicznej myszy.

Usuń móżdżek i przeprowadź sekcję mózgu. Oddziel tkankę korowo-hipokampową zawierającą neurony pobudzające wyrażające białka fluorescencyjne.

Przenieść tkankę na płytkę hodowlaną zawierającą bufor.

Zmiel tkankę i przenieś ją do probówki zawierającej papainę.

Papaina trawi macierz zewnątrzkomórkową tkanki, rozluźniając komórki, w tym neurony.

Przenieś strawioną tkankę do probówki z białkami BSA, zatrzymując aktywność enzymatyczną i zapobiegając uszkodzeniom komórek.

Mechanicznie dysocjuj tkanki, uwalniając komórki.

Odwirować i usunąć sklarowany osad zawierający zanieczyszczenia i enzymy.

Ponownie zawiesić komórki w pożywkach neuronalnych o niskiej fluorescencji i przefiltrować przez sitko komórkowe, usuwając agregaty komórkowe.

Wykonaj sortowanie komórek aktywowane fluorescencją, aby zidentyfikować i posortować neurony fluorescencyjne.

Przenieś posortowane neurony do probówki mikrowirówkowej i odwiruj. Ponowne zawieszenie neuronów w pożywkach neuronalnych.

Neurony nasienne na szkiełkach nakrywkowych pokrytych poli-L-lizyną na płytce wielodołkowej. Neurony przylegają do pokrytych powierzchni.

Dodaj pożywkę neuronalną. Inkubuj, aby ułatwić wzrost neuronów.

Najpierw wypreparuj móżdżek i oddziel dwie półkule. Następnie ostrożnie oddziel hipokamp i korę od każdej półkuli. Przenieść wypreparowaną tkankę na 35-milimetrową szalkę Petriego zawierającą schłodzony bufor do hodowli komórkowych.

Następnie przenieś wypreparowany hipokamp i korę na pokrywę innej 35-milimetrowej szalki Petriego. Używając płaskiej krawędzi ostrza skalpela, ostrożnie posiekaj tkankę ruchami krzyżowymi, aż pozostaną tylko małe kawałki.

Następnie przenieś posiekaną tkankę z niewielką ilością roztworu papainy z pokrywki szalki Petriego do sterylnej probówki do papainy. Inkubuj tkankę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 25 minut. Po inkubacji papainy przenieś sterylną probówkę do papainy i sterylne probówki BSA do komory przepływowej. Następnie użyj 1-mililitrowej pipety Pasteura, aby przenieść tylko tkankę korowo-hipokampową z rurki papainy do rurki BSA 1.

Aby rozbić wszelkie duże grudki tkanki, należy kilkakrotnie rozcierać tkankę za pomocą 1-mililitrowej pipety Pasteura. Następnie należy siedmiokrotnie rozcierać tkankę za pomocą pipety Pasteura z cienką końcówką. Po 30 sekundach przenieś 1 mililitr dolnego roztworu i tkanki z probówki BSA 1 do probówki BSA 2.

Kilkakrotnie roztarć tkankę w probówce BSA 2 za pomocą pipety Pasteura z cienką końcówką. Po roztarciu przenieść 1 mililitr dolnej tkanki w roztworze z probówki BSA 1 do probówki BSA 3. Kilkakrotnie roztarć tkankę w probówce BSA 3

.

Po roztarciu przenieść cały roztwór i tkankę z probówek 2 i 3 do probówki BSA 1. Rozcierać jeszcze 2 do 3 razy i odwirowywać przy 3 000 razy g przez 3 minuty. Po odwirowaniu ostrożnie usunąć supernatant z granulowanej tkanki i ponownie zawiesić komórki za pomocą pipety P1000 w 2 mililitrach kompletnego podłoża hibernacyjnego A o niskiej fluorescencji. Następnie należy rozcierać tkankę 20 razy, aby zapewnić całkowite ponowne zawieszenie roztworu tkankowego.

Następnie przefiltrować zawiesinę komórek przez sito komórkowe o średnicy 30 mikrometrów do probówki z polistyrenu. Przygotować probówki do sortowania komórek, pipetując 300 mikrolitrów kompletnego podłoża hibernacyjnego A do wymaganej liczby probówek polipropylenowych.

Dla każdego typu ogniwa fluorescencyjnego, które ma być sortowane, należy dobrać odpowiednie filtry wzbudzenia i emisji. Wzbudz białko żylne za pomocą długości fali wzbudzenia 488 nanometrów i wykryj emitowane światło przez zestaw filtrów emisyjnych 530 na 40.

Wzbudz białko TdTomato za pomocą długości fali wzbudzenia 531 nanometrów i wykryj emitowane światło przez zestaw filtrów emisyjnych 575 ponad 30. Aby uzyskać wysoką czystość, sortuj jaskrawo oznaczone komórki fluorescencyjne. Po posortowaniu komórek przenieś zebrane komórki do 2-mililitrowych okrągłodennych probówek wirówkowych. Następnie odwiruj komórki z prędkością 3,000 razy g przez 3 minuty, aby utworzyć osad komórkowy.

Ponownie zawiesić osad komórkowy w wymaganej ilości wstępnie podgrzanego, kompletnego podłoża NBA, aby osiągnąć gęstość komórek 1,000 komórek na mikrolitr. Aby potwierdzić obecność zdysocjowanych komórek, sprawdź roztwór komórek pod mikroskopem za pomocą soczewki obiektywowej 4x lub 10x. Przed posianiem komórek należy wirować ze średnią prędkością przez 2 do 3 sekund, aby zapewnić równomierne zawieszenie komórek.

Po wirowaniu szybko odpipetować 10 mikrolitrów zawiesiny komórek do środka każdego szkiełka nakrywkowego. Po godzinie nakarm komórki 500 mikrolitrami wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki NBA i wróć do inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza.