JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuronauka
0 wyświetleń • 2:51 min • July 8th, 2025
Zacznij od płytki wielodołkowej zawierającej porowatą wkładkę, która zawiera rusztowanie polistyrenowe o trójwymiarowej porowatej strukturze.
Dodaj etanol, aby nawodnić rusztowanie i umyj je pożywką.
Wprowadzić pożywkę zawierającą białko macierzy zewnątrzkomórkowej, lamininę. Inkubować, aby laminina pokryła rusztowanie.
Wysiewaj ludzkie nerwowe komórki macierzyste w pożywce nerwowej zawierającej czynniki wzrostu na rusztowaniu pokrytym lamininą.
Inkubuj, aby umożliwić migrację komórek macierzystych do porowatego rusztowania, gdzie laminina sprzyja przyleganiu komórek do rusztowania.
Komórki wykorzystują czynniki wzrostu i namnażają się w tym rusztowaniu.
Dodaj pożywkę neuronalną wolną od czynnika wzrostu i regularnie wymieniaj zużytą pożywkę, aby utrzymać żywotność komórek.
Brak czynników wzrostu stymuluje różnicowanie komórek macierzystych w neuronalne komórki progenitorowe.
Z biegiem czasu procesy neuronalne tych komórek progenitorowych wydłużają się, umożliwiając wielokierunkowy wzrost komórek i tworzenie trójwymiarowej hodowli.
Ponownie nawodnić rusztowania, dodając do każdej studzienki 12-dołkowej płytki Alvetex 2 mililitry 70% etanolu, przygotowanego przy użyciu wody do nawadniania. Unikaj dotykania rusztowań, dozując 70% etanolu po ścianie każdej studni. Ostrożnie odessać 70% etanolu i natychmiast umyć rusztowania 2 mililitrami na studzienkę DMEM F12 przez jedną minutę.
Powtórz procedurę prania dwukrotnie. Ostrożnie zassać DMEM F12 po ostatnim praniu. Pokryj rusztowania, dodając 2 mililitry lamininy w DMEM F12 do każdej studzienki. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze nawilżanym 5% dwutlenkiem węgla przez co najmniej dwie godziny.
Następnie umyj płytkę ciepłym DMEM F12. Zasiej każde rusztowanie około 500 000 ludzkich nerwowych komórek macierzystych lub HNSC w objętości 150 mikrolitrów pożywki RMM z czynnikami wzrostu. Inkubować płytkę przez trzy godziny, aby komórki mogły osiąść na rusztowaniach.
Po trzech godzinach dodaj 3,5 mililitra RMM do każdej studzienki, uważając, aby nie usunąć komórek z rusztowań. Inkubuj płytkę przez siedem lub 21 dni. Wymień pożywkę po jednym dniu, który jest pierwszym karmieniem, i ponownie wymień pożywkę 2 do 3 dni po pierwszym karmieniu.