Generowanie zazwojowych neuronów współczulnych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Weź mikropłytkę pokrytą macierzą zewnątrzkomórkową i dodaj ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste zawieszone w pożywce różnicowej.

Pożywka zawiera cząsteczki sygnałowe, które wpływają na komórkowe szlaki sygnałowe, kierując różnicowanie do nerwowych komórek progenitorowych.

Wprowadź inną pożywkę różnicującą zawierającą cząsteczki sygnałowe, które indukują różnicowanie w komórki grzebienia nerwowego lub NCC, prekursory komórek neuronalnych i nieneuronalnych.

Dodaj enzymy, aby zakłócić macierz, rozdzielając w ten sposób komórki.

Przemyć w celu zneutralizowania enzymów, a następnie odwirować i wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić NCC w pożywce sferoidalnej i przenieść je na mikropłytkę.

Czynniki wzrostu pożywki i małe cząsteczki indukują tworzenie sferoidów.

Suplement z kwasem retinowym, który wspomaga różnicowanie się w współczulne neurony progenitorowe.

Przenieś sferoidę na mikropłytkę pokrytą białkiem adhezyjnym w pożywce do dojrzewania neuronów współczulnych, powodując przyczepienie sferoidów.

Neuronalne czynniki wzrostu i kwas retinowy w pożywce sprzyjają dojrzewaniu do zazwojowych neuronów współczulnych, które są częścią obwodowego układu nerwowego i regulują procesy mimowolne.

Na dzień przed indukcją różnicowania pokryj odpowiednią liczbę sześciodołkowych płytek dwoma mililitrami matrycy membrany podstawnej na studzienkę i przechowuj płytki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego ranka podgrzej płytki do temperatury pokojowej i umyj gotową do podziału hodowlę ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych dwa razy świeżym PBS na mycie.

Po drugim myciu potraktuj komórki siedmioma mililitrami 0,5 milimolowego EDTA przez 15 minut w inkubatorze hodowli komórkowych, a następnie odessaj pływające ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste i przenieś pobrane komórki do 50-mililitrowej probówki.

Dodaj równą objętość PBS do probówki, aby rozcieńczyć EDTA i zbierz komórki przez odwirowanie. Zawiesić osad w jednym mililitrze pożywki różnicującej dnia 01. Przed dodaniem odpowiedniej objętości pożywki do liczenia, rozcieńczyć komórki do stężenia 1,25 x 10⁵ komórek na centymetr kwadratowy w dwóch mililitrach pożywki różnicującej na studzienkę.

Odessać cały roztwór matrycy błony podstawnej z każdej studzienki uprzednio przygotowanej płytki sześciodołkowej. Następnie wysiewaj 2 mililitry komórek do każdej studzienki i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych. Następnego ranka nakarm komórki 3 mililitrami pożywki różnicującej dnia 01 na dołek.

W drugim dniu różnicowania nakarm komórki trzema mililitrami pożywki różnicującej z dnia drugiego do dziesięciu na dołek. Następnie karm komórki co drugi dzień aż do 10 dnia. Aby zagregować komórki grzebienia nerwowego w sferoidy, w dniu 10 umyj komórki PBS i dodaj dwa mililitry pożywki dysocjacyjnej do każdej studzienki. Po 20 minutach w inkubatorze do hodowli komórkowych przenieś pływające komórki do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów i doprowadź objętość zawiesiny w probówce do 50 mililitrów świeżym PBS.

Zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w wystarczającej objętości pożywki sferoidalnej z dnia 10 do 14 w celu zliczenia. Po zliczeniu rozcieńczyć komórki do stężenia 5 x 10⁵ komórek na 500 mikrolitrów, używając pożywki sferoidalnej dnia 10 do 14 i wprowadzić 500 mikrolitrów komórek do każdej studzienki 24-dołkowej płytki o bardzo niskim przyłączeniu. Następnie włóż komórki z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych.

Aby wywołać minimalną hodowlę sferoidów, w 11 dniu hodowli nakarm sferoidy grzebienia nerwowego dodatkowymi 500 mikrolitrami pożywki sferoidalnej z dnia 10 do 14 na studzienkę. W dniu 12 przechyl płytkę, aby zgromadzić sferoidy po jednej stronie płytki i ostrożnie zassaj jak najwięcej pożywki z każdej studzienki bez zasysania sferoid. Następnie nakarm sferoidy jednym mililitrem pożywki sferoidalnej z dnia 10 do 14 na studzienkę.

Aby wywołać rozszerzoną hodowlę sferoidów w dniu 15, nakarm sferoidy 1,5 mililitra sferoidalnego podłoża z dnia 10 do 14 uzupełnionego 0,5 mikromolowym kwasem retinowym na studzienkę. Następnie włóż sferoidy z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych.

W celu różnicowania neuronów współczulnych w 14 lub 28 dniu przechyl płytkę, aby zgromadzić sferoidy po jednej stronie płytki i ostrożnie zassaj jak najwięcej pożywki. Nakarm komórki jednym mililitrem pożywki dla neuronów współczulnych.

Aby rozbić duże skupiska sferoidów na mniejsze sferoidy, dodaj nie więcej niż jeden mililitr pożywki na studzienkę i pipetuj sferoidy pięć do 10 razy przed rozdzieleniem.

I usuń nadmiar fibronektyny z lamininą z wcześniej przygotowanych płytek 24-dołkowych. Podzielić płytkę na jeden mililitr sferoid z każdej studzienki na 24-dołkowej płytce do hodowli sferoidów między czterema oddzielnymi dołkami nowo pokrytej płytki 24-dołkowej. Dodaj 250 mikrolitrów świeżej pożywki z neuronów współczulnych do każdej studzienki i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych. Następnego ranka zastąp pożywkę w każdej studzience jednym mililitrem pożywki dla neuronów współczulnych uzupełnionej 0,125 mikromolowym kwasem retinowym i włóż płytkę z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych. Po 35 dniach nakarm neurony, ostrożnie zastępując tylko połowę istniejącej pożywki w każdej studzience świeżą pożywką.