Generowanie indukowanych pluripotencjalnych organoidów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych

Weźmy kolonie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych lub iPSC, hodowane na macierzy nośnej.

Dodaj roztwór zawierający enzymy, aby zdysocjować kolonie na pojedyncze komórki.

Przenieś komórki do probówki, odwiruj je i odrzuć supernatant.

Ponownie zawiesić iPSC w pożywce wzrostowej.

Przenieś komórki do mikropłytki zawierającej biokompatybilne włókna polimerowe.

Wirowanie w celu wymuszenia agregacji iPSC, tworzących ciała embrionoidalne lub EB, na rusztowaniu polimerowym.

Przejście na pożywkę indukcji neuronalnej, która wspomaga proliferację i różnicowanie iPSC w nerwowe komórki macierzyste, komórki progenitorowe i niedojrzałe neurony.

Podczas inkubacji komórki ulegają samoorganizacji.

Umieść ciała zarodków na arkuszu z wgłębieniami i dodaj krople zawierające białka macierzy zewnątrzkomórkowej.

Inkubować w celu zestalenia matrycy, osadzając EB.

Przenieś EB do mikropłytki zawierającej pożywkę do konserwacji neuronów. Inkubować.

EB ulegają proliferacji komórkowej, tworząc wypukłości i pączki oraz różnicując się w dojrzałe neurony, tworząc organoidy mózgowe.

Odessać pożywkę pipetą i raz umyć komórki DPBS. Następnie dodaj 500 mikrolitrów roztworu do odrywania komórek lub 0,5 milimolowego EDTA, aby dysocjować kolonie i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 3 do 5 minut. Następnie dodaj 1 mililitr świeżej pożywki E8 do każdego dołka i delikatnie odpipetuj pipetę, aby odłączyć wszystkie komórki.

Przenieś całą zawiesinę komórek do 15-milimetrowej probówki wirówkowej i dodaj kolejny 1 mililitr świeżej pożywki E8. Następnie wiruj komórki z masą 290 g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.

Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 mililitrze pożywki E6, uzupełnionej 50 mikromolowym inhibitorem ROCK i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.

Przygotować zawiesinę komórkową o pożądanej gęstości osadzenia w pożywce E6, uzupełnioną inhibitorem ROCK. Następnie dodaj 150 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdego dołka 96-dołkowej płytki o bardzo niskim mocowaniu.

Następnie odwiruj płytkę o masie 290 g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, aby wymusić agregację komórek. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej atmosferze z 5% dwutlenkiem węgla w celu utworzenia ciała zarodkowego.

Po 24 godzinach inkubacji przenieść płytkę do kaptura i ostrożnie odessać 120 mikrolitrów pożywki za pomocą pipety, uważając, aby nie zassać ciała zarodka poprzez zbyt głębokie opuszczenie końcówki pipety do studzienki.

Następnie dodaj 150 mikrolitrów świeżej pożywki E6, uzupełnionej 2 mikromolowymi XAV939 i inhibitorami SMAD do każdej studzienki. Przenieść płytkę z powrotem do inkubatora i codziennie zastępować pożywkę świeżo przygotowanym E6 uzupełnionym inhibitorami.

W siódmym dniu inkubacji sprawdź, czy wszystkie ciała zarodków osiągnęły średnicę od 550 do 600 mikrometrów i wykazują gładką, wyraźną krawędź. Na tym etapie są gotowe do osadzenia w macierzy zewnątrzkomórkowej.

Aby osadzić organoidy, przygotuj arkusze do osadzania z wgłębieniami, umieszczając 4-calowy arkusz termoplastycznej folii uszczelniającej na pustym pudełku P200. Następnie użyj 15-mililitrowej stożkowej probówki lub 500-mikrolitrowej probówki wirówkowej i delikatnie dociśnij arkusz folii do otworów, aby uzyskać 12 lub żądaną liczbę wgłębień.

Następnie spryskaj arkusz folii 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia wewnątrz okapu przy włączonym świetle UV przez co najmniej 30 minut. W międzyczasie rozmrozić wystarczającą ilość macierzy błony podstawnej na lodzie. Następnie, używając końcówki P200 o szerokim otworze, przenieś jeden korpus zarodka z płytki 96-dołkowej do każdego wgłębienia. Usuń jak najwięcej pożywki za pomocą zwykłej końcówki pipety, ale nie pozwól, aby ciało zarodka wyschło.

Następnie, za pomocą zwykłej, wstępnie schłodzonej końcówki P200, dodaj około 30 mikrolitrów nierozcieńczonej matrycy błonowej do każdego organoidu, upewniając się, że ciało zarodka znajduje się jak najbliżej środka kropli.

Gdy wszystkie ciała zarodkowe zostaną osadzone w matrycy, umieść arkusz filmu na sterylnej szalce Petriego. Następnie inkubować szalkę Petriego w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut w wilgotnej atmosferze z 5% dwutlenkiem węgla, aby umożliwić zestalenie się matrycy membranowej.

W celu różnicowania organoidów dodać 5 mililitrów przygotowanej pożywki różnicującej z witaminą B27 bez witaminy A do jednego dołka 6-dołkowej płytki o bardzo niskim przyłączeniu. Podgrzej płytkę do 37 stopni Celsjusza w inkubatorze. Gdy matryca błony zestala się, przenieś osadzone ciała zarodkowe na płytkę 6-dołkową, wypychając wgłębienia z tyłu arkusza folii. W razie potrzeby użyj 1 mililitra pożywki ze studzienki i odpipetuj ją na arkusz, aby oderwać kropelki od arkusza folii.