Generowanie połączeń nerwowo-mięśniowych za pomocą urządzenia mikroprzepływowego

Zacznij od urządzenia mikroprzepływowego pokrytego polimerem z połączonymi ze sobą studniami zawierającymi lustrzane przedziały, które są połączone za pomocą mikrorowków.

Umieść neuronalne komórki progenitorowe w studzienkach jednego przedziału.

Pozwól im migrować do połączonego kanału i przylegać do polimeru.

Nakładka z pożywką wzrostową w celu pobudzenia dojrzewania neuronów do neuronów ruchowych.

W przeciwległym przedziale zasiej dołki komórkami progenitorowymi mięśni, które migrują i przylegają do połączonego kanału.

Zastąp pożywkę pożywką różnicującą, indukując fuzję komórek progenitorowych mięśni i tworząc wielojądrowe komórki mięśniowe.

Dodaj pożywkę różnicującą neurony zawierającą czynniki wzrostu do przedziału zawierającego komórki mięśniowe.

W międzyczasie dodaj połowę objętości pożywki wolnej od czynnika wzrostu do przedziału zawierającego komórki nerwowe.

Czynniki wzrostu i większa objętość pożywki w przeciwległym przedziale sprzyjają neuronom ruchowym do rozszerzania swoich procesów przez mikrorowki.

Te procesy neuronalne łączą się następnie z komórkami mięśniowymi, tworząc połączenia nerwowo-mięśniowe.

Aby umieścić neuronalne komórki progenitorowe lub NPC w urządzeniu mikroprzepływowym, usuń DPBS z dwóch studzienek po jednej stronie mikrorowków w urządzeniu za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów. Aby zasiać łącznie 250 000 NPC w 60 do 100 mikrolitrach pożywki z neuronami ruchowymi dnia 10 na urządzenie w prawym górnym dołku, zasiej połowę zawiesiny komórkowej blisko otworu kanału pod kątem 45 stopni.

Zatrzymaj się na kilka sekund, aby zawiesina komórek przepłynęła przez kanał przed dodaniem pozostałej połowy zawiesiny komórek do dolnej studzienki. Użyj długopisu, aby oznaczyć stronę z nasionami jako NPC lub równoważny, aby ułatwić orientację urządzenia bez mikroskopu i inkubuj przez pięć minut w celu przyczepienia komórek. Następnie powoli uzupełnij dwie studzienki nasienne NPC dodatkowym podłożem neuronów ruchowych dnia 10 do całkowitej objętości 200 mikrolitrów na studzienkę. Za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów usuń DPBS z dwóch dołków po drugiej stronie mikrorowków naprzeciwko świeżo wysianych NPC.

Dodaj 200 mikrolitrów pożywki neuronów ruchowych dnia 10 na studzienkę do dołków bez nasion. Następnie dodaj 6 mililitrów DPBS na 10-centymetrową naczynie wokół urządzenia, aby zapobiec parowaniu pożywki podczas inkubacji.

Aby zmienić pożywkę, powoli usuń pożywkę z obu studzienek za pomocą NPC, umieszczając końcówkę pipety o pojemności 200 mikrolitrów na dolnej krawędzi ściany studzienki naprzeciwko otworu kanału. Aby zapobiec uszkodzeniu komórek w kanale przez silny przepływ pożywki, powoli dodawaj od 50 do 100 mikrolitrów świeżej pożywki neuronów ruchowych do każdej studzienki, ciągle przełączając się między górną i dolną studzienką. Powtarzaj proces, aż każda studzienka będzie zawierała 200 mikrolitrów pożywki.

W 17 dniu różnicowania neuronów ruchowych usuń pożywkę neuronu ruchowego po niezasianej stronie mikrorowków w urządzeniu za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów i umyj studzienki DPBS. Wysiewaj łącznie 200 000 ludzkich pierwotnych mezoangioblastów lub MAB w 60 do 100 mikrolitrach pożywki wzrostowej na urządzenie, wysiewając połowę zawiesiny komórkowej w górnej studzience.

Zatrzymaj się na kilka sekund, aby zawiesina komórkowa mogła przepłynąć przez kanał przed wysianiem pozostałej połowy zawiesiny komórek w dolnej studzience, jak pokazano wcześniej w przypadku posiewu NPC. Inkubuj urządzenie przez pięć minut w celu przyłączenia komórek. Następnie uzupełnij dwie studzienki świeżo wysiane MAB dodatkowym podłożem wzrostowym i ponownie inkubuj, jak pokazano.

Aby zainicjować gradient chemotaktyczny i wolumetryczny w 21 dniu różnicowania neuronów ruchowych, dodaj 200 mikrolitrów na studzienkę podłoża podstawowego neuronu ruchowego zawierającego czynniki wzrostu do przedziału miotuby. Następnie dodaj 100 mikrolitrów na studzienkę podłoża podstawowego neuronu ruchowego bez czynników wzrostu do przedziału neuronu ruchowego.