Prosta technika izolacji i hodowli mysich astrocytów

Pokrój korę myszy na małe kawałki i przenieś do zimnego podłoża preparacyjnego zawierającego zbuforowany roztwór soli.

Dodaj enzymy trawienne, aby dysocjować macierz zewnątrzkomórkową.

Aby usunąć resztki enzymów, przemyć zimnym medium preparacyjnym.

Zastąp tę pożywkę pożywką wzbogacającą astrocyty.

Następnie użyj pipety, aby oddzielić kawałki tkanki.

Przepuścić zawiesinę przez sitko, aby usunąć niezdysocjowaną tkankę i uzyskać pojedyncze komórki.

Przenieś ogniwa na dodatnio naładowaną płytkę pokrytą polimerem. Inkubować z potrząsaniem.

Astrocyty mocno przylegają, podczas gdy luźno związane neurony, mikroglej i oligodendrocyty odłączają się.

Pożywka wzbogacająca przekształca dojrzałe astrocyty w dzielące się astrocyty wielokątne.

Usuń oderwane komórki i umyj astrocyty buforem fosforanowym.

Dodaj enzymy trawienne, aby odłączyć astrocyty.

Dodaj pożywkę zawierającą surowicę, aby zatrzymać aktywność enzymatyczną. Zbierz astrocyty do probówki i odwiruj.

Odrzucić supernatant. Ponownie zawieś komórki w pożywce do dojrzewania astrocytów, aby promować typową dojrzałą strukturę astrocytów w kształcie gwiazdy.

Pokrój dowolną tkankę korową, która ma być użyta do wytworzenia astrocytów, na kawałki nie większe niż 1 milimetr sześcienny. Po zebraniu wszystkich kawałków tkanki poczekaj, aż osiądą na dnie probówki. Następnie odessać jak najwięcej pożywki. Następnie dodaj 2 do 3 mililitrów 0,05% trypsyny EDTA i inkubuj próbki w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut.

Następnie ostrożnie odessaj trypsynę EDTA, pozostawiając kawałki tkanek w minimalnej ilości płynu na dnie probówki. Następnie dodaj 5 mililitrów wstępnie schłodzonej pożywki preparacyjnej, aby zmyć pozostałą trypsynę EDTA i pipetuj z boku górnej probówki, aby uzyskać wymieszanie kawałków tkanki. Następnie odessać podłoże preparacyjne i pozostawić kawałki tkanki w jak najmniejszej ilości płynu.

Powtórz ten etap mycia z użyciem wstępnie schłodzonego podłoża preparacyjnego dwukrotnie. Po ostatnim etapie mycia dodaj 1 mililitr DMEM PLUS o temperaturze pokojowej i miareczkuj chusteczkę, pipetując w górę iw dół bez wprowadzania pęcherzyków.

Astrocyty są dość wrażliwe na pH, dlatego ważne jest, aby unikać wytwarzania pęcherzyków, ponieważ może to zmienić pH roztworu.

Następnie umieść sitko o średnicy 100 mikronów w otworze 50-mililitrowej rurki i wstępnie zwilż filtr 4.5 mililitrami wstępnie schłodzonego DMEM PLUS. Odpipetować 1 mililitr zdysocjowanej zawiesiny tkankowej na sitko komórkowe i dodać kolejne 4,5 mililitra wstępnie schłodzonego DMEM PLUS, aby przepłukać przez niego komórki. W dniu in vitro 7 po sekcji umieść 10-centymetrowe szalki z komórkami w DMEM PLUS na wytrząsarce w inkubatorze i potrząsaj szalkami z prędkością 110 obr./min przez sześć godzin.

20 do 30 minut przed końcem sześciogodzinnego wstrząsania podgrzej 1X PBS, DMEM PLUS, NB+H i 0,25% trypsyny EDTA do 37 stopni w łaźni wodnej. Po sześciu godzinach wstrząsania zdejmij naczynia hodowlane z shakera i natychmiast zastąp podłoże 10 mililitrami wstępnie podgrzanego 1X PBS na naczynie. Następnie usuń PBS i dodaj 3 mililitry wstępnie podgrzanej trypsyny EDTA na naczynie.

Następnie inkubować próbki przez cztery minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie dodaj 5 mililitrów wstępnie podgrzanego DMEM PLUS do 3 mililitrów trypsyny EDTA w każdym naczyniu. Odpipetuj komórki z naczynia i zbierz zawiesinę komórek do 50-mililitrowej probówki. Następnie odwirować zawiesinę komórkową 3,220 razy g w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez cztery minuty. Następnie usuń supernatant, a następnie ponownie zawieś osad komórkowy w 1 mililitrze wstępnie podgrzanego NB+H.