Opracowanie kokultury neuronów i makrofagów in vitro

Zacznij od izolowanych neuronów zwojowych mysiego korzenia grzbietowego w podłożu wzrostowym.

Umieść je na pokrytej polimerem płytce wielodołkowej, aby promować przyczepienie neuronów.

Następnie weź wypreparowaną mysz poddaną eutanazji i wstrzyknij lodowaty PBS do jej jamy otrzewnej.

Delikatnie masuj otrzewną, aby usunąć makrofagi ze ściany otrzewnej.

Ściśnij mysz, aby zebrać płyn otrzewnowy i potraktuj ją buforem do lizy, aby selektywnie lizować czerwone krwinki, które pojawiają się jako zanieczyszczenia. Odwirować i ponownie zawiesić komórki w pożywce hodowlanej.

Przenieś makrofagi do porowatej wkładki umieszczonej w studzience zawierającej hodowane neurony.

Ta kokultura pozwala neuronom i makrofagom znajdować się w bliskiej odległości.

Potraktuj kokulturę db-cAMP i inkubuj, aby ułatwić jej wejście do komórek. To aktywuje neurony do wydzielania cząsteczek sygnałowych.

Te cząsteczki sygnałowe, wraz z db-cAMP, indukują makrofagi do przyjęcia fenotypu proregeneracyjnego i wydzielania niezbędnych czynników do wzrostu neuronów.

Przed założeniem kultury należy wstępnie pokryć 6-dołkową płytkę poli-D-lizyną i lamininą. Następnie inkubować 6-dołkową płytkę z 0,01 poli-D-lizyną w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny lub w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez noc. Następnie dwukrotnie umyj talerz wodą destylowaną.

Następnie inkubować płytkę z roztworem lamininy w stężeniu 3 mikrogramów na mililitr przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Następnie umyj płytkę dwukrotnie wodą destylowaną i wysusz ją w temperaturze pokojowej przez co najmniej godzinę.

Teraz naciąć skórę pokrywającą kręgosłup myszy poddanej eutanazji za pomocą ostrza chirurgicznego i wypreparować mięśnie przykręgosłupowe obustronnie, aby odsłonić kości kręgowe. Usuń kości kręgowe skrupulatnie za pomocą wąskiego rondu chirurgicznego, aż DRG zostaną całkowicie odsłonięte.

Pod mikroskopem preparacyjnym usuń DRG obustronnie od S1 aż do poziomu C1 za pomocą nożyczek do irydektomii i kleszczyków z cienką końcówką. Przenieś DRG do 1,5-mililitrowej probówki Eppendorf za pomocą niebieskiej końcówki pipety z odciętym końcem.

Następnie usuń DMEM po szybkim wirowaniu przez kilka sekund za pomocą mini-wirówki. Dodać 1 mililitr DMEM zawierającego 125 jednostek na mililitr kolagenazy typu 11 i inkubować probówkę przez 90 minut, delikatnie obracając za pomocą skrętu lub wytrząsarki w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie wyrzuć DMEM zawierający kolagenazę i dodaj 1 mililitr świeżego DMEM. Przenieś DRG do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów za pomocą niebieskiej końcówki pipety z odciętym końcem. Następnie delikatnie pipetować w górę i w dół, co najmniej 15 razy, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórek.

Odwirować probówkę o masie 239 g przez trzy minuty i ostrożnie wyrzucić supernatant wraz z pływającymi zanieczyszczeniami. Dodaj 1 mililitr pożywki neuropodstawowej uzupełnionej witaminą B27 i ponownie zawiesić osad komórkowy, delikatnie pipetując w górę iw dół pięć do 10 razy.

Następnie przepuść zawiesinę komórek przez 70-mikrometrowe sitko do komórek nałożone na 50-mililitrową stożkową rurkę. Następnie umieść wszystkie zebrane neurony DRG na dwóch dołkach 6-dołkowej płytki.

Aby przygotować pierwotne makrofagi otrzewnowe od dorosłej myszy, delikatnie naciąć skórę brzucha, aby odsłonić otrzewną i unikać przecinania otrzewnej, aby zapobiec wyciekowi płynu z płukania.

Następnie nakłuj otrzewną za pomocą strzykawki z igłą o rozmiarze 22 i wstrzyknij 10 mililitrów lodowatego PBS do jamy otrzewnej. Delikatnie masuj otrzewną przez jedną do dwóch minut. Następnie wyciągnij igłę i wyciśnij PBS przez miejsce nakłucia igły i zbierz płyn z płukania w 50-mililitrowej stożkowej tubce.

Następnie odwiruj płyn popłuczynowy o masie 239 g przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby osadzać składniki komórkowe. Następnie ponownie zawiesić osad z 3 mililitrami buforu do lizy czerwonych krwinek na trzy minuty w temperaturze pokojowej.

Następnie ponownie odwirować zawiesinę komórkową o masie 239 g przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Ponownie zawiesić granulowane komórki w 1 mililitrze neurobazalnej pożywki B27. Umieść połowę wszystkich zebranych makrofagów na wkładce do hodowli komórkowej o efektywnej powierzchni 4,2 centymetra kwadratowego, którą umieszcza się na górze studzienki zdysocjowanego DRG.

Cztery godziny po wspólnej hodowli makrofagów neuronów dodaj 2 mikrolitry 100-mikromolowego roztworu cyklicznego AMP db do kokultur makrofagów neuronów. Po 24 godzinach napełnij pustą studzienkę 1 mililitrem pożywki do hodowli makrofagów na tej samej 6-dołkowej płytce.

Przenieś wkładkę do hodowli komórkowej w kokulturze makrofagów neuronów do pustej studzienki z pożywką do hodowli makrofagów.